Молекулярная биология

Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и, в более широком смысле, к противомикробным препаратам – естественное биологическое явление, создающее серьезные проблемы здравоохранению. Первые случаи массового появления устойчивых штаммов бактерий были отмечены в середине 20 века; с тех пор резистентность регистрируется во всем мире, а в последние два десятилетия все чаще выявляют множественную лекарственную устойчивость. Развитию резистентности способствует злоупотребление антибактериальными средствами, а также выбросы таких средств в окружающую среду. К сожалению, поиск и разработка новых эффективных антибиотиков сокращается, тогда как требуется усиление этой работы, а также поиск альтернативных методов терапии инфекционных заболеваний.

Несмотря на почти столетнюю историю терапии гонококковой инфекции разнообразными антимикробными препаратами, в мире ежегодно регистрируют более 80 млн случаев данного заболевания. Возбудитель гонореи Neisseria gonorrhoeae обладает исключительными способностями формировать устойчивость к антибиотикам благодаря высокой генетической пластичности. Будучи облигатным патогеном, гонококк выработал механизмы, позволяющие обходить защитные системы хозяина, взаимодействуя как с врожденным, так и с адаптивным иммунитетом у мужчин и женщин, и способен обитать внутри эпителиальных клеток, макрофагов и нейтрофилов. Благодаря генетической изменчивости и горизонтальному транспорту генов сформировались штаммы, резистентные к каждому из препаратов, применяемых в терапии гонореи. Ключевую роль в горизонтальной передаче генов играет система секреции типа IV, функциональность которой служит двигателем развития устойчивости к антимикробным препаратам. В представленном обзоре рассмотрены механизмы патогенеза гонококковой инфекции и ускользания возбудителя от иммунного ответа, формирования его устойчивости к антибиотикам и генетической изменчивости, методы лабораторного анализа и тенденции в развитии новых подходов к диагностике и терапии гонококковой инфекции.

В обзоре рассмотрены вопросы, связанные с распространением генов антибиотикорезистентности в микробных сообществах окружающей среды. Отмечены “горячие точки” адаптивной эволюции, накопления и распространения антибиотикорезистентных бактерий и генетического материала резистентности к антибиотикам. К таким “горячим точкам” относятся антропогенные экосистемы, такие как очистные сооружения муниципальных сточных вод, полигоны твердых коммунальных отходов, животноводческие предприятия и агроценозы. Рассмотрено влияние различных типов поллютантов и биотических факторов на усиление мутагенеза и горизонтального переноса генов резистентности к антибиотикам. Показана роль мобильных генетических элементов в мобилизации и ускоренном распространения детерминант резистентности. Отдельное внимание уделено роли окислительного стресса и стрессовых регулонов, которые активируются для реализации и контроля молекулярно-генетических механизмов адаптивной эволюции бактерий и при горизонтальном распространении генетического материала в бактериальных популяциях. Окислительный стресс выделен как один из основных активаторов дестабилизации генома и адаптивной эволюции бактерий.

Исследованы острая и субхроническая токсичность фармакологической пары инкапсулированный фермент Citrobacter freundii C115H метионин-γ-лиаза/пролекарство (метиин) на самках мышей стока ICR. Препарат показал слабый/умеренный дозозависимый гепатотоксический эффект; большинство изменений морфологии печени относились к несущественным или слабовыраженным отклонениям от нормы. Длительное применение однократной терапевтической дозы 1.5 Ед C. freundii C115H метионин-γ-лиаза @ (PEG−P(Asp)₇₀/PLL₇₀)-PIC-сом/2 мг метиин на мышь приводило к незначительному снижению веса животных без явных признаков интоксикации; морфология печени у четверти животных не имела отклонений от нормы. Не обнаружено нефротоксического эффекта во всех использованных в исследовании группах.

Цистатионин-γ-лиаза (CSE) ‒ ключевой фермент генерации сероводорода у таких патогенных бактерий, как Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и других. Подавление активности CSE значительно усиливает чувствительность бактерий к действию антибиотиков. Нами разработан метод синтеза нового ингибитора CSE индольного ряда – 3-амино-5-[(6-бром-1H-индол-1-ил)метил]тиофена (MNS1). Синтез этого соединения базируется на модификации замещенного тиофена в качестве основного структурного фрагмента, который на финальных стадиях вовлекается в алкилирование 6-броминдола. Константа диссоциации комплекса MNS1 с SaCSE (цистатионин-γ-лиаза S. aureus) составляет 0.5 мкМ, что на порядок ниже, чем для CSE человека (hCSE). Показано, что соединение MNS1 эффективно усиливает антибактериальное действие гентамицина на клетки Bacillus subtilis, что предполагает его использование в качестве потенциатора антибиотиков для подавления роста бактериальных клеток, экспрессирующих CSE.

Bacillus cereus sensu lato (s.l.) объединяет такие генетически, морфологически и физиологически близкие виды грамположительных спорообразующих бактерий с высоким патогенным потенциалом, как, например, B. anthracis, B. cereus и B. thuringiensis. Токсин-продуцирующие штаммы B. cereus s.l. представляют большую опасность для здоровья человека. Высокая степень сходства видов, входящих в этот комплекс, сильно затрудняет их идентификацию и быстрое принятие адекватных мер при вызываемых ими заболеваниях. Ранее мы охарактеризовали клинический изолят CCGC 19/16, принадлежащий B. cereus s.l., который имел черты как B. cereus, так и B. cytotoxicus. В настоящей работе с помощью мультилокусного типирования последовательностей (MLST) и масс-спектрометрического анализа изолят CCGC 19/16 идентифицирован как B. cytotoxicus. Показано также, что штамм CCGC 19/16, в отличие от других представителей вида B. сytotoxicus, не обладает термотолерантностью, а от B. cereus этот штамм отличает чувствительность к большинству антибиотиков и повышенная подвижность. Как и B. cereus, штамм CCGC 19/16 формирует зоны β-гемолиза в кровяном агаре. Кроме того, длительное хранение образцов перед анализом может привести к неверной идентификации изолята. Полученные нами результаты указывают на то, что “быстрые методы” анализа, использующие единичные гены, имеют недостаточную разрешающую силу в идентификации видов B. cereus s.l. Достаточную разрешающую силу дает сочетание MLST-анализа с MALDI-TOF MS.

Назначение адекватной эмпирической терапии требует проведения локального мониторинга распространения резистентных к антибиотикам бактерий в каждом стационаре. Целью работы было сравнение частоты встречаемости энтеробактерий (Enterobacterales) с продукцией β-лактамаз у пациентов отделений терапевтического и хирургического профиля. Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом. Продукцию β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) подтверждали методом “двойных дисков”, карбапенемаз – модифицированным методом инактивации карбапенемов. Наличие генов карбапенемаз и их экспрессию определяли с помощью ПЦР в режиме реального времени и иммунохроматографическим методом. Среди выделенных энтеробактерий больше трети продуцировали БЛРС как в отделениях терапевтического профиля (35.51%), так и хирургического (39.85%). Доля продуцентов карбапенемаз была сопоставима в обеих группах и составила 8.41% и 9.77% соответственно. В хирургических отделениях преобладали металло-β-лактамазы, а в терапевтических – сериновые. Среди внебольничных энтеробактерий продуценты β-лактамаз выделяли реже, чем среди нозокомиальных – как в терапевтических (31.48% и 56.6%), так и в хирургических отделениях (45.45% и 51%), но без статистически значимых различий. За три года исследования нами не выявлено увеличения доли продуцентов β-лактамаз в хирургических и терапевтических отделениях стационара, но, безусловно, проведение локального мониторинга необходимо продолжать – с целью выработки локальной стратегии рационального применения антибактериальных препаратов.

В настоящее время при лечении инфекционных заболеваний часто применяют эмпирические схемы терапии, не основанные на данных о резистентности возбудителя. Одна из главных причин необоснованного назначения антибактериальных препаратов – отсутствие быстрых и в то же время универсальных методов определения антибиотикорезистентности патогена. Наиболее широко применяемые культуральные технологии, такие как метод микроразведений, требуют длительного времени для наращивания нужного количества бактериальных клеток. Менее времязатратные методы оценки резистентности (геномные или протеомные) базируются на определении специфических маркеров (генов устойчивости, сверхэкспрессии определенных белков и др.); при этом конкретный протокол чаще всего применим к узкому числу как штаммов микроорганизмов, так и антибиотиков. Ранее нами продемонстрирована возможность применения технологии спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) света для количественного определения продукта жизнедеятельности бактериальных клеток в МТТ-тесте – формазана, – причем напрямую, в клеточной суспензии. Отсутствие стадии выделения формазана упрощает анализ и повышает его точность. Время проведения исследования не превышало 2 ч при сохранении универсальности самого МТТ-теста. К ограничениям разработанного протокола по КР-детекции результатов МТТ-теста следует отнести высокий порог чувствительности по концентрации бактериальных клеток – 10⁷ КОЕ/мл, в связи с чем образцы с низким содержанием бактерий проходят предварительную стадию культивирования. Здесь мы предлагаем способ повышения чувствительности определения формазана за счет использования эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) на наночастицах золота. В результате проведенного исследования подобраны оптимальные условия проведения ГКР-спектроскопии формазана как в растворе, так и в суспензии клеток Escherichia coli. Усиление сигнала формазана за счет применения ГКР на наночастицах золота позволило снизить порог чувствительности по числу бактериальных клеток в образце не менее чем в 30 раз – до 3 × 10⁵ КОЕ/мл. Такая чувствительность не предел возможности разработанного протокола ГКР – введение в эксперимент других типов наночастиц, например оптимизированных по форме, размеру, концентрации, может дать дополнительное усиление ГКР-сигнала.

Внеклеточный матрикс обеспечивает механическую поддержку клеток и участвует в регуляции клеточной активности. Нарушение функций внеклеточного матрикса при метаболических отклонениях или старении может приводить к развитию заболеваний. Разработка протекторов внеклеточного матрикса актуальна для этиотропной профилактики и лечения патологий, связанных с изменением внеклеточного матрикса. Ключевыми механизмами формирования патологических изменений во внеклеточном матриксе являются неэнзиматические реакции, такие как гликирование и гликоксидация. Перспективность потенциальных протекторов внеклеточного матрикса можно оценить по их способности ингибировать гликирование и гликоксидацию. Изучена способность соединений на основе гетероциклических скаффолдов, содержащих частично гидрированный изоиндольный фрагмент, замедлять образование конечных продуктов гликирования. Исследование проведено методами in silico и in vitro. В ходе исследования in silico с применением метода ab initio с базисным набором функций 6-311G(d, p) мы определили энергии граничных молекулярных орбиталей соединений. Затем оценили их антигликирующую активность в реакции гликирования бычьего сывороточного альбумина глюкозой (альбумин рассматривали в качестве модельного белка). В качестве соединения сравнения использовали пиридоксамин. Антигликирующую активность соединений оценивали спектрофлуориметрически путем измерения флуоресцирующих продуктов при длинах волн возбуждения/испускания 440/520 нм (обычно не используемых для оценки антигликирующих свойств). Использование этих длин волн позволяет выявлять продукты гликирования и окисления в коже человека, количество которых, в отличие от некоторых других продуктов гликирования, коррелирует с календарным возрастом. Экспериментально установлено, что значения энергий граничных молекулярных орбиталей могут служить предикторами способности соединений замедлять образование флуоресцирующих продуктов, определяемых при длинах волн возбуждения/испускания 440/520 нм. Ингибирование образования указанных флуоресцирующих продуктов может иметь значение для лечения и профилактики заболеваний, в том числе метаболических, фиброзирующих или возрастных. Установлено также, что антигликирующие свойства наиболее выражены в ряду гидрированных 3a,6-эпоксиизоиндоло-7-карбоновых кислот (соединения типа XIII) и циклопента[b]фуро[2,3-c]пиррол-3-карбоновых кислот (структуры типа XIX), взятых в концентрации 100 мкМ.

Белки семейства TRIM принимают участие как в процессах врожденного иммунитета, так и в работе нервной системы и могут играть важную роль в развитии нейродегенеративных заболеваний. В представленной работе анализировали экспрессию 35 генов семейства TRIM в нейральных предшественниках, терминально дифференцированных нейронах и глиальных производных, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток здоровых доноров и пациентов с болезнью Паркинсона, в условиях отсутствия воспалительных стимулов и при индукции неспецифического воспалительного ответа под воздействием TNFα. Экспрессия лишь небольшого числа генов TRIM в нейральных предшественниках и терминально дифференцированных нейронах пациентов с болезнью Паркинсона, отличалась от экспрессии в клетках здоровых доноров. Под влиянием TNFα в терминально дифференцированных нейронах активировалась экспрессия отдельных генов TRIM, более существенная в клетках пациентов с болезнью Паркинсона в сравнении с клетками здоровых доноров. В глиальных производных пациентов с болезнью Паркинсона экспрессия многих генов TRIM была изначально ниже, чем в клетках здоровых доноров, и оставалась низкой или дополнительно снижалась после воздействия TNFα. Полученные данные демонстрируют различия в вовлеченности ряда генов мультигенного семейства TRIM в процессы, протекающие при болезни Паркинсона в нейронах и в глии, а также показывают разнонаправленное влияние воспалительного стимула на экспрессию целого ряда генов TRIM в этих трех типах клеток. Учитывая важную роль многих генов TRIM в работе врожденной иммунной системы, можно предположить, что при болезни Паркинсона в глии происходят более значительные нарушения в работе генов этого семейства по сравнению с нейронами.