Immunocytochemical characteristic of the endometrial mucosa HIV-infected women

Full Text

Введение

Первые исследования, проведенные в Африке, показали, что у ВИЧ-инфицированных женщин рождаемость на 40% ниже, чем у ВИЧ-негативных. Исследование B. Zaba и соавт. стало одной из первых работ, в которых обсуждается взаимосвязь между ВИЧ/СПИД и бесплодием [1]. Аналогичное по дизайну исследование подтвердило данный тезис: по данным эпидемиологического исследования (n=413) распространенность ВИЧ-инфекции у бесплодных женщин заметно выше, чем у фертильных, – 18,2 и 6,6% соответственно [2].

Снижение фертильности у ВИЧ-инфицированных женщин описано в США в более поздних исследованиях: частота наступления беременности составила 7,4 и 15,2 на 100 человеко-лет у серопозитивных и серонегативных женщин соответственно (p<0,0001). При этом использование антиретровирусных препаратов также ассоциировано со снижением шансов на зачатие как для моно-, так и для комбинированной терапии: относительный риск 0,34 (95% доверительный интервал 0,49–0,98) и относительный риск 0,34 (95% доверительный интервал 0,03–4,28) соответственно [3]. Прямое и опосредованное (прежде всего за счет изменения состояния иммунной системы) влияние ВИЧ на физиологию репродуктивной системы может быть причиной снижения фертильности у ВИЧ-инфицированных женщин. Продемонстрировано, что у ВИЧ-инфицированных женщин достоверно чаще отмечается бесплодие, ассоциированное с отсутствием овуляции, и/или аменорея, при этом тяжесть ВИЧ/СПИД находится в обратной зависимости с количеством овуляторных циклов [4, 5]. В целом у ВИЧ-позитивных женщин намного раньше наступает истощение функции яичников, что показали несколько исследований, в которых измеряли уровни фолликулостимулирующего гормона, антимюллерова гормона и/или ингибина В [6, 7]. По данным испанского исследования, как у женщин (n=130), так и у мужчин (n=121), больных ВИЧ-инфекцией, отмечались факторы и сопутствующие заболевания, значительно влияющие на показатели фертильности обоих полов. Однако у половины включенных в данное исследование пациентов диагностирован также вирусный гепатит С, что могло исказить истинную картину бесплодия при ВИЧ-инфекции [8]. Тем не менее установление прямой связи между ВИЧ-инфекцией и бесплодием осложняется наличием коинфекций (вирусные гепатиты, рецидивирующий герпес, инфекции, передаваемые половым путем), системных заболеваний, острым и хроническим стрессом, а также вредными привычками (курение, употребление алкоголя и психоактивных веществ).

Несмотря на множество полученных данных, истинные причины снижения фертильности у ВИЧ-инфицированных пациенток неизвестны. В связи с системным и локальным снижением количества нейтрофилов и нарушением их функции (хемотаксиса и фагоцитоза) происходит изменение ответа на инвазию патогена в иммунной системе слизистых оболочек [9]. Рассматривая эндометрий как часть мукозального отдела иммунной системы [10], можно предположить, что ВИЧ-инфекция приводит к нарушению локального иммунного гомеостаза эндометрия, что способствует нарушению процессов инвазии трофобласта в эндометрий.

Цель исследования – изучить некоторые параметры расположенного в эндометрии мукозального отдела иммунной системы у ВИЧ-инфицированных женщин и влияние иммуномодулирующей терапии на показатели данных параметров.

Материалы и методы

Общий дизайн

Проведено сравнительное иммуноцитохимическое исследование (ИЦХИ) эндометрия у пациенток с ВИЧ-инфекцией (n=12) на предмет определения уровней экспрессии антигенов CD20, CD56 и TLR9. В группу сравнения для ИЦХИ вошли пациентки без ВИЧ-инфекции, проходившие обследование с целью планирования беременности (n=22), у которых аспират эндометрия забирали в те же сроки менструального цикла. Эти пациентки составили группу сравнения. Объем обследования и критерии включения/невключения для обеих групп пациенток были одинаковыми. В качестве прегравидарной подготовки пациентки обеих групп получали нуклеоспермат натрия.

Критерии включения:

1. Женщины от 18 до 49 лет включительно.
2. Наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании.
3. Полное обследование пациентки согласно приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30.08.2012 №107н (в ред. Приказов Минздрава РФ от 11.06.2015 №332н, от 01.02.2018 №43н).
4. Планирование естественной беременности или беременности с помощью разных методов вспомогательных репродуктивных технологий.

Критерии невключения:

1. Возраст пациентки моложе 18 или старше 49 лет.
2. Наличие хотя бы одного артифициального аборта и/или более одного самопроизвольного выкидыша в анамнезе.
3. Нерегулярный менструальный цикл.
4. Хронические или острые воспалительные, хронические атрофические и/или онкологические заболевания женских половых органов.
5. Наличие репродуктивно значимых инфекций и дисбиотических нарушений микрофлоры влагалища.
6. Оперативные вмешательства на наружных или внутренних половых органах в течение 12 мес до включения в исследование.
7. Родоразрешение путем операции кесарева сечения в анамнезе.
8. Положительный анализ на гепатиты В и С.
9. Психиатрические заболевания, алгоколизм и/или наркомания в настоящее время или в анамнезе, злокачественные новообразования и/или лимфопролиферативные заболевания в анамнезе, включая дисплазии любой степени.
10. Любые другие клинические заболевания и/или состояния, которые, по мнению исследователей, могут повлиять на результаты.

Клиническая характеристика пациенток, включенных в исследование

В обследование включены пациентки, пораженные ВИЧ-инфекцией (далее – ВИЧ), которым проводится лечение в Центре по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями (руководитель – академик Н.А. Беляков). Возраст пораженных ВИЧ-инфекцией на момент обследования составлял от 26 до 49 лет (n=12); табл. 1.

 

Таблица 1. Клиническая характеристика ВИЧ-инфицированных пациенток Table 1. Clinical characteristics the HIV-infected patients
Номер пациентки	Возраст в момент включения в исследование	Год предполагаемого инфицирования	Год взятия на учет по поводу ВИЧ	Год начала антиретровирусной терапии
1	34	1999	2002	2007
2	28	2000	2002	2010
3	31	2002	2003	2006
4	26	2008	2009	2010
5	32	2008	2010	2010
6	38	2008	2008	2009
7	40	2001	2003	2009
8	49	2007	2008	2008
9	36	2001	2001	2005
10	38	2009	2009	2010
11	42	2002	2004	2009
12	35	2000	2000	2005

 

ВИЧ-инфицированные пациентки планировали беременность, при этом пациентки 40 лет и старше планировали проведение программы вспомогательных репродуктивных технологий с использованием ооцитов донора. Сравнительно небольшой размер выборки объясняется достаточно жесткими критериями включения/невключения в исследование, в результате чего снизилось влияние других медицинских и социальных факторов, потенциально способных влиять на фертильность (табл. 2).

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика исследуемых групп Table 2. Baseline characteristics of the women including in study
Показатель	Значение
	Всего	ВИЧ «+»	ВИЧ «-»
Число пациенток, n	34	12	22
Возраст, лет:
Минимальный–максимальный*	26–49	26–49	28–41
Средний**	33,35±2,9	35,75±0,77	35,14±0,80
Медиана (25%; 75% перцентиль)	35 (31,25; 39,5)	36 (32; 38)	36 (32; 38)
Коэффициент вариации	17,66	12,22	13,14
W	0,979	0,956	0,968
A	0,835	0,550	0,490
Акушерский анамнез***
Количество родов, n (%):
не было	16 (47,1)	4 (33,3)	12 (54,5)
1	18 (52,9)	8 (66,7)	10 (45,5)
Количество выкидышей***, n (%):
не было	26 (76,5)	9 (75,0)	17 (77,3)
1	8 (23,5)	3 (25,0)	5 (22,7)
Курение n (%):
курят	14 (41,2)	5 (41,7)	9 (40,9)
не курят	20 (58,8)	7 (58,3)	13 (59,1)
Примечание. А – критерий Андерсона–Дарлинга, W – критерий Шапиро–Уилка; *регламентировано дизайном исследования; **в момент начала обследования; ***в момент госпитализации по поводу инфицированного выкидыша.

Объем обследования

Всем пациенткам с целью проверки на соответствие критериям включения и отсутствие критериев исключения выполнялся следующий объем обследований.

• Путем аспирационной биопсии с помощью вакуумной кюретки (катетер Пайпеля) по стандартной методике выполнялось взятие аспирата из полости матки с последующим ИЦХИ препарата, выполненным по ранее апробированной и зарекомендовавшей себя методике с набором соответствующих антител (на антигены CD20, CD56 и TLR9) [11, 12]. Биопсия выполнялась дважды, на 7–10-й день менструального цикла, до и после лечения нуклеосперматом натрия.
• Исследование отделяемого из цервикального канала на репродуктивно значимые инфекции, для чего использовали метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени («ДНК-технология», Москва) для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae, вируса простого герпеса и цитомегаловируса.
• Исследование отделяемого из влагалища методом «Фемофлор-16» для выявления соотношения ДНК факультативных и облигатных анаэробов [13], в том числе Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis, Candida spp., к количеству лактобацилл.
• Исследование крови на вирусные гепатиты В и С.

ВИЧ-инфицированным пациенткам дополнительно выполнялось определение вирусной нагрузки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (real-time PCR) на аппарате Diagnostic Rosche, а удельный вес (%) CD3 в крови ВИЧ-инфицированных пациенток оценивался методом проточной цитометрии на аппарате FACS Calibur (Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционным заболеваниями).

Назначение иммуномодулирующей терапии

Пациентки обеих групп в качестве прегравидарной подготовки получали по ранее доказавшей свою эффективность схеме лечения [11, 12, 14] натрия нуклеоспермат ректально по 1 введению (25,0 мл) в день при помощи микроклизмы с интервалом в 3 дня; продолжительность терапии составила 42 дня (6 нед).

Статистический анализ результатов

Описание количественных признаков в зависимости от варианта распределения признаков представлено в виде среднего значения ± стандартное квадратичное отклонение и/или в виде медианы (с границами 25 и 75% перцентиля), качественные признаки представлены в виде долей (%), абсолютных чисел. Выбор варианта дальнейшего статистического анализа зависел от сравниваемых признаков (группы признаков). Для сравнения частоты встречаемости признака в сравниваемых группах применяли непараметрический точный критерий Фишера и/или парный Ud-критерий (Вилкоксона), также выполняли расчет критерия хи-квадрат (÷²). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) считали равным 0,05.

Этические правила и нормы

Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека», действующими порядками и стандартами оказания медицинской помощи и другими применимыми регуляторными требованиями к проведению клинических исследований и наблюдательных программ в Российской Федерации. Протокол наблюдения за пациентами, программа дополнительного лечения и обследования одобрены локальным этическим комитетом.

Результаты

Результаты вирусной нагрузки и удельный вес (частота) CD3-клеток ВИЧ-инфицированных пациенток представлены на рис. 1, 2.

 

Рис. 1. Вирусная нагрузка.

 

Рис. 2. Частота CD3 (%) в крови у ВИЧ-инфицированных пациенток, выявленная методом проточной цитометрии, в точке взятия материала на ИЦХИ эндометрия.

 

В аспирате из полости матки клетки, позитивные по искомым антигенам, окрашивались в коричневые тона хромогеном диаминобензидином (рис. 3).

 

Рис. 3. Клетка, позитивная по антигену CD20. Аспират из полости матки ВИЧ-инфицированной пациентки. Иммуноцитохимия. х1000.

 

Частота клеток, экспрессирующих антигены CD20, CD56 и TLR9, в препаратах эндометрия у пациенток из группы сравнения (обследуемых по поводу планирования беременности) и у ВИЧ-инфицированных принципиально отличалась (табл. 3).

 

Таблица 3. Уровни экспрессии CD20, CD56 и TLR9 в слизистой эндометрия у пациенток до и после лечения Table 3. Expression of CD20, CD56 and TLR9 in the uterine mucosa in patients before and after treatment the uterine mucosa
Показатель	ВИЧ «+»		ВИЧ «-»
	до лечения	после лечения	до лечения	после лечения
CD20, %	5,44±0,88	3,21±0,46***	4,07±0,73	1,61±0,34**‡
CD20, nотр (%)	0	2 (1,67%)	4 (18,18)	6 (27,27)
CD56, %	7,64±0,92*	4,18±0,38***	2,9±1,6*	2,7±0,29**
CD56, nотр (%)	0	3 (25,0)	5 (27,73)	5 (27,73)
TLR9, %	0,33±0,18*	1,29±0,54***	1,22±0,35*	2,49±0,86
TLR9, nотр (%)	8 (66,67)	3 (25,0)	5 (27,73)	3 (13,64)
Примечание: nотр – число пациентов с отрицательными результатами; *различия между сравниваемыми признаками у ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных пациенток до лечения; **различия между сравниваемыми признаками у ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных пациенток после лечения; ***различия между сравниваемыми признаками в группе ВИЧ-инфицированных до и после лечения; ‡различия между сравниваемыми признаками в группе сравнения до и после лечения.

 

При этом отмечали снижение экспрессии TLR9 и повышение экспрессии CD20 и CD56 у ВИЧ-инфицированных пациенток, что говорит о наличии хронического эндометрита. Как видно из рис. 4, документирующего ИЦХИ материала эндометрия с использованием моноклональных антител на антиген CD56, клетки-киллеры (NK-клетки) могут образовывать скопления, что может указывать на высокую степень инфильтрации эндометрия при хроническом эндометрите у ряда пациенток, обследуемых по поводу планирования беременности.

 

Рис. 4. Клетки, позитивные по антигену CD56. Скопления клеток отмечены стрелками. Аспират из полости матки пациентки, обследуемой по поводу планирования беременности. Иммуноцитохимия, х1000.

 

После проведенного лечения нуклеосперматом натрия отмечено снижение инфильтрации слизистой эндометрия клетками, экспрессирующими CD20- и/или CD56-антиген, что свидетельствует о снижении активности воспаления (рис. 5).

 

Рис. 5. Частота клеток, экспрессирующих антигены CD20, TLR9 и CD56 в слизистой эндометрия у пациенток, обследуемых по поводу бесплодия, до и после лечения нуклеосперматом натрия; *p<0,05.

 

ИЦХИ продемонстрировало, что клетки, экспрессирующие Toll-like-рецепторы (TLR) 9-го типа – TLR9 (рис. 6), в группе ВИЧ-инфицированных пациенток до лечения нуклеосперматом натрия регистрировались с низкой частотой.

 

Рис. 6. Клетки, экспрессирующие TLR9. Аспират из полости матки пациентки, обследуемой по поводу планирования беременности. Иммуноцитохимия, х1000.

 

Однако после лечения нуклеосперматом натрия в данной группе пациенток частота клеток, экспрессирующих TLR9, значимо повысилась (см. табл. 3). Полученные результаты свидетельствуют о принципиальных различиях по частоте исследуемых клеток в слизистой эндометрия у ВИЧ-инфицированных и условно здоровых пациенток. Корреляционный анализ между вирусной нагрузкой, частотой CD3 в крови ВИЧ-инфицированных и данными экспрессии антигенов в эндометрии не выявил связи между данными событиями.

Обсуждение

Важнейшим звеном между заболеванием матки и бесплодием является воспаление. Система врожденного иммунитета немедленно реагирует на патогены, распознавая эволюционно выбранные наиболее консервативные молекулы, общие для инфекционных патогенов или образующиеся в результате повреждения тканей [15]. Примерами таких структур могут служить компоненты бактериальных стенок: липополисахариды грамотрицательных бактерий, пептидогликаны и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, флагеллин, вирусные нуклеиновые кислоты.

Эпителий слизистых оболочек насыщен клетками, способными к презентации антигенов, совокупность которых образует мукозальный отдел иммунной системы [16, 17]. Достоверно установлено, что немедленный ответ врожденной системы иммунитета млекопитающих в ответ на вторжение патогена опосредован главным образом через семейство рецепторов, получивших название TLR. Данные рецепторы экспрессируются на макрофагах, нейтрофилах, естественных киллерах, дендритных клетках и распознают высококонсервативные молекулы (домены), свойственные целым группам микроорганизмов, так называемые патогенассоциированные молекулярные паттерны (PAMP – pathogen-associated molecular patterns) [18]. На клеточном и тканевом уровне связывание TLRs с PAMP приводит к активации транскрипции тканеспецифичных генов, кодирующих различные провоспалительные цитокины, хемокины и ассоциированные с ними факторы, также необходимые для развития дальнейшего иммунного ответа [19]. В нашем исследовании отмечено повышение экспрессии CD20 и CD56 у ВИЧ-инфицированных пациентов, что является признаком наличия хронического эндометрита.

Экспрессия определенных типов TLR в нижних и верхних отделах женского репродуктивного тракта различается: регулярная экспрессия TLR1 и TLR6 (TLR 1 и 6-го типа) независимо от фазы цикла регистрируется в эпителии слизистой как верхних, так и нижних отделов репродуктивного тракта (маточные трубы, эндометрий, эндо- и эктоцервикс и влагалище) [20, 21]. Интересно отметить, что экспрессия TLR1 регистрировалась на NK-клетках и эндотелиальных клетках сосудов эндометрия матки, тогда как экспрессию TLR6 можно было выявить на NK-клетках и на фибробластах подслизистой влагалища. Регулярная экспрессия TLR2 регистрируется в клетках слизистой и стромы всех отделов репродуктивного тракта, при этом в стромальных клетках эндометрия экспрессия TLR2 выше по сравнению с клетками однослойного цилиндрического эпителия. Пик экспрессии TLR2 регистрируется в секреторную фазу менструального цикла [22, 23]. Следствием активации TLR9 может быть повышение количества ряда цитокинов, включая интерлейкин-8, на что убедительно указывают экспериментальные данные. Неметилированные CpG олигонуклеотиды, которые являются агонистами TLR9, индуцируют продукцию интерлейкина-8 первичными клетками, изолированными из ткани маточных труб и шейки матки [24, 25]. Следует отметить, что полиморфизм TLR9 ассоциирован с персистенцией цитомегаловируса и вируса Эпштейна–Барр в слизистой эпителия репродуктивного тракта [26, 27]. Снижение экспрессии TLR9 у ВИЧ-инфицированных пациенток может свидетельствовать об отсутствии способности врожденного иммунитета элиминировать патогены, ассоциированные с субклиническим воспалением, что коррелирует с повышением экспрессии маркеров хронического эндометрита.

Заключение

Полученные нами данные указывают, что в момент взятия материала у ВИЧ-инфицированных пациенток экспрессия TLR9 была ниже, а экспрессия маркеров хронического эндометрита – выше по отношению к группе сравнения.

About the authors

Irina N. Vorobtsova

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Author for correspondence.
Email: ririna-1979@yandex.ru

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 2, Litovskay street, Saint-Peterburg, 194100

Natalya I. Tapilskaya

Saint Petersburg State Pediatric Medical University; Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology

Email: tapnatalia@yandex.ru

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, 2, Litovskay street, Saint-Peterburg, 194100; 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Elena S. Orlova

Kirov Military Medical Academy

Email: oes17@yandex.ru

Senior Res. Officer

Russian Federation, 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

Nikolay N. Rukhlyada

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Email: nicolasr@mail.ru

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, 2, Litovskay street, Saint-Peterburg, 194100

Sergei N. Proshin

Saint Petersburg State University

Email: psnjsn@rambler.ru

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, 7/9, Universitetskaya embankment, Saint-Petersburg, 199034

Ruslan I. Glushakov

Saint Petersburg State Pediatric Medical University; Kirov Military Medical Academy

Email: glushakovruslan@gmail.com

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 2, Litovskay street, Saint-Peterburg, 194100; 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

References

Supplementary files