Outcomes of Assisted Reproductive Technology Programs Using Oocytes of Patients in Late Reproductive Age with Various Culture Media: A retrospective study

Full Text

Введение

Современные общественные и экономические условия в мире создают новые тенденции, согласно которым супружеские пары все чаще откладывают реализацию репродуктивной функции, что приводит к увеличению обращаемости пар позднего репродуктивного возраста в центры репродуктивной медицины [1, 2]. Успех программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) зависит от множества факторов, в том числе от ответа на овариальную стимуляцию, частоты формирования бластоцист и их качества, возраста женщины [3]. Поздний репродуктивный возраст женщины является одной из главных причин неудач в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [4], что, прежде всего, обусловлено биологическим старением яичников, которое приводит к увеличению частоты хромосомных аномалий и генетических мутаций [5, 6]. Кроме того, поздний репродуктивный возраст ассоциирован с осложненным течением беременности и перинатальными осложнениями [7]. Принимая во внимание необратимое влияние биологического и овариального старения на репродуктивный потенциал, современные условия требуют оптимизации стратегии ведения пациенток позднего репродуктивного возраста с целью улучшения исходов программ ЭКО. И если такие показатели, как овариальный резерв, повышение частоты хромосомных аномалий и генетических мутаций, в настоящее время не являются модифицируемыми факторами, то оптимизация эмбриологического этапа – перспективный подход в достижении успеха в лечении бесплодия. Внимание специалистов репродуктивной медицины сосредоточено на изучении особенностей раннего эмбриогенеза – области, которая не является до конца изученной ввиду множества ограничений. Знания о физиологических условиях эмбрионального развития, в том числе особенностей метаболического окружения, привели к разработке культуральной среды с пониженным содержанием лактата. Согласно результатам исследований в настоящее время отсутствуют доказанные преимущества определенных сред культивирования над другими [8]. Однако в данных работах не учитывается возможность оптимизации протоколов ведения супружеских пар с модификацией эмбриологического этапа в зависимости от потребностей, возникающих в различных клинических ситуациях. Таким образом, высокая частота неудач ВРТ у пациенток позднего репродуктивного возраста стала основой для изучения значения культуральной среды с пониженным содержанием лактата в повышении эффективности программ ЭКО в рассматриваемой возрастной когорте.

Цель исследования – изучение исходов программ ВРТ с собственными ооцитами у пациенток позднего репродуктивного возраста при применении культуральной среды с пониженным содержанием лактата и классической культуральной среды.

Материалы и методы

В ретроспективное исследование включены 340 супружеских пар, которые проходили лечение в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия им. профессора Б.В. Леонова ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» в 2020–2022 гг. Принимая во внимание клинический опыт и результаты многочисленных исследований, которые демонстрируют резкое снижение эффективности ВРТ при достижении женщиной возраста 40 лет [4, 9, 10], для оценки значимости возрастного фактора в исходах программ ВРТ супружеские пары разделены на группы 1 (35–39 лет) и 2 (40–42 года). В группу 1 вошли 200 супружеских пар, в группу 2 – 140. Критериями включения в исследование стали протоколы только с собственными ооцитами, получение как минимум 1 ооцит-кумулюсного комплекса (ОКК) в результате овариальной стимуляции и последующей трансвагинальной пункции, перенос эмбриона в полость матки, а также подписанное супругами информированное добровольное согласие на участие. Критериями исключения были противопоказания к лечению бесплодия методами ВРТ согласно Приказу Минздрава России №803н от 31 июля 2020 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению», нарушения нормального кариотипа супругов, выраженные нарушения сперматогенеза. В зависимости от культуральной среды, в которой культивировали эмбрионов, каждая из возрастных групп в свою очередь была разделена на две подгруппы: когорта 35–39 лет – на подгруппу 1 (n=115), где использовали среду с пониженным лактатом CSCM-NX («Фуджифильм Ирвайн Сайнтифик Йнк.», США), и подгруппу 2 (n=85) с культивированием эмбрионов в одноэтапной классической среде G-TL («Витролайф», Швеция); когорта 40–42 лет – на подгруппу 1 (n=70) с культивированием эмбрионов в среде с пониженным содержанием лактата CSCM-NX и подгруппу 2 (n=70) с культивированием эмбрионов в одноэтапной классической среде G-TL. Согласно анализу состава метаболитов, который проведен в независимом исследовании D. Morbeck и соавт. (2017 г.), концентрация лактата в среде CSCM-NX практически вдвое ниже, чем в классической среде G-TL (5,71 и 10,01 мМоль/мл соответственно) [11]. 

Овариальную стимуляцию проводили по протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ант-ГнРГ) с индивидуальным подбором препаратов и их доз. Через 35–37 ч после введения триггера овуляции выполняли трансвагинальную пункцию яичников. Далее собирали полученные ОКК в среду с содержанием буфера HEPES («GametBuffer», «Витролайф», Швеция). Оплодотворение осуществляли с применением интрацитоплазматической инъекции сперматозоида согласно утвержденным стандартным операционным процедурам лаборатории. Через 16–18 ч проводили оценку оплодотворения. Через 120 ч осуществляли морфологический анализ эмбрионов согласно классификации Гарднера [12].

Беременность определяли путем лабораторного и инструментального обследования – исследования уровня β-субъединицы хорионического гонадотропина человека (β-ХГЧ) спустя 14 дней после переноса эмбриона и ультразвукового исследования органов малого таза. Беременность диагностировали при уровне β-субъединицы хорионического гонадотропина человека более 20 МЕ/л в сыворотке крови и обнаружении плодного яйца в полости матки на 20–22-й день после переноса эмбриона при проведении ультразвукового исследования органов малого таза.

Конечными точками исследования выбраны клинические показатели: частота наступления беременности (%), частота ранних репродуктивных потерь до 12 нед гестации (%), частота живорождения (%) в расчете на перенос эмбриона.

Статический анализ результатов проводили с помощью стандартной программы Microsoft Excel и программного обеспечения IBM SPSS Statistics v. 27.0.1.0, а оценку соответствия нормальному распределению анализируемых параметров – с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для описания категориальных бинарных данных использовали абсолютные числа N и процентные доли от общего числа пациенток (%). При распределении признаков, отличающихся от нормального, применяли методы непараметрической статистики с указанием медианы, верхнего (Q1) и нижнего квартилей – Me (Q3) [25-й; 75-й перцентили]. При сравнении количественных признаков использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни, качественных признаков – тест хи-квадрата Пирсона. Учитывая анализ как количественных, так и качественных признаков, корреляционный анализ проводили с использованием непараметрического корреляционного критерия Спирмена. С помощью преобразования Фишера определяли 95% доверительный интервал для коэффициента корреляции. Для оценки тесноты корреляционной связи использовали критерии, согласно которым абсолютные значения r_xy<0,3 свидетельствуют о слабой связи, 0,3–0,7 – о связи средней тесноты, r_xy>0,7 – о сильной связи. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05.

Результаты

На первом этапе в обеих возрастных когортах проведен анализ антропометрических показателей, а также данных соматического, гинекологического и репродуктивного анамнеза. Межгрупповой сравнительный анализ в группе 1 (35–39 лет) не выявил различий в возрасте: 37 [37; 39] лет в группе культивирования эмбрионов в среде с пониженным содержанием лактата и 37 [38; 38] лет в группе традиционного культивирования (p=0,767). Индекс массы тела был также сопоставим между двумя подгруппами (p=0,650). Межгрупповой анализ соматической патологии в данной возрастной группе достоверно значимых различий не выявил, за исключением заболеваний эндокринной системы. Так, в подгруппе с традиционным культивированием частота выявления патологии эндокринной системы (аутоиммунного тиреодита, первичного гипотиреоза) составила 34,1% (29/85), тогда как в подгруппе с культивированием в низколактатной среде – лишь 18,3% (21/115); p=0,001. Тем не менее вклад патологий эндокринной системы не представляется значимым, поскольку до вступления в программу ЭКО данные заболевания были компенсированы. При анализе гинекологического анамнеза статистически значимых различий не получено. Наиболее распространенными заболеваниями в приведенной возрастной когорте для обеих подгрупп были миома матки, наружный генитальный эндометриоз, диффузная форма аденомиоза I–II степени и хронический эндометрит. Анализ репродуктивного анамнеза не выявил достоверных различий по частоте родов, ранних репродуктивных потерь и искусственного прерывания беременности в подгруппах данной возрастной когорты. Общая структура бесплодия в исследуемых подгруппах представлена на рис. 1. Следует отметить, что межгрупповые достоверные различия не выявлены.

 

Рис. 1. Общая структура бесплодия в первой (a) и второй (b) возрастных группах женщин, %.

Fig. 1. The breakdown of infertility in the first (a) and second (b) age groups of women, %.

 

Межгрупповой анализ возрастных данных у пациенток группы 2 (40–42 лет) достоверных различий не выявил: для подгруппы 1 медиана возраста составила 41 [40; 41] год, для подгруппы 2 – 41 [40; 42] (p=0,280). Антропометрические характеристики также были сопоставимы: индекс массы тела 22,85 [21, 50; 24, 61] и 22,82 [20, 88; 24, 54] для подгрупп 1 и 2 соответственно (p=0,737). Анализ соматической и гинекологической заболеваемости не выявил статистически значимых различий между подгруппами 1 и 2. При анализе репродуктивного анамнеза также не получено статистически значимых различий по частоте медицинского аборта, репродуктивных потерь и живорождений между сравниваемыми подгруппами. 

При сравнении показателей гормонального исследования между двумя возрастными группами получены статистически значимые различия в уровне антимюллерова гормона (АМГ): в группе женщин 35–39 лет он составил 1,59 [1, 10; 2, 60] нг/мл, в группе 40–42 лет – 1,35 [0, 90; 2, 47] нг/мл (p=0,008). Сравнительный анализ концентрации АМГ между подгруппами 1 и 2 внутри данных возрастных когорт не выявил различий. 

Следующим шагом был анализ результатов овариальной стимуляции и эмбриологического этапа в обеих возрастных когортах. Сравнительный анализ в группе 35–39 лет не выявил статистически значимых различий в подгруппах. Так, количество дней овариальной стимуляции не различалось в подгруппах и составило 9 [8; 10] (p=0,115). Статистически значимых различий в суммарной дозе гонадотропинов также не выявлено (1800 [1425; 2025] и 1650 [1412; 2100] МЕ в подгруппах 1 и 2 соответственно; p=0,746). Количество ОКК составило 5 [4; 9] в подгруппе 1 и 5 [4; 7] в подгруппе 2 (p=0,976), количество метафазных II ооцитов (МII) – 4 [3; 6] для обеих подгрупп (p=0,646). Анализ эмбриологического этапа показал, что культивирование эмбрионов в культуральной среде с пониженным содержанием лактата не приводит к улучшению результатов эмбриологического этапа у женщин 35–39 лет. Наиболее важные показатели – частота бластуляции и количество бластоцист – были одинаковыми в обеих подгруппах (p=0,603 и p=0,460 соответственно); табл. 1.

 

При анализе параметров овариальной стимуляции и эмбриологического этапа в группе 2 (40–42 года) получены отличные от группы 1 (35–39 лет) результаты. Так, параметры и результаты овариальной стимуляции были сопоставимы между подгруппой 1, где культивировали эмбрионы в низколактатной среде, и подгруппой 2, в которой их культивировали в классической среде (табл. 2). При анализе эмбриологического этапа получены статистически значимое повышение частоты формирования бластоцист (p=0,04) и увеличение количества бластоцист (p=0,04) при культивировании эмбрионов в среде с пониженным содержанием лактата по сравнению с классической средой (см. табл. 2).

 

В когорте женщин 35–39 лет перенос эмбрионов выполнен 115 пациенткам из подгруппы 1, где эмбрионы культивировали в среде с пониженным содержанием лактата, и 85 пациенткам из подгруппы 2, в которой эмбрионов культивировали в классической среде. Анализ клинических исходов не выявил статистически значимых различий между подгруппами: частота биохимической и клинической беременности, а также репродуктивных потерь была сопоставима между подгруппами. Достоверные различия не получены и по частоте живорождений между подгруппами (p=0,76); табл. 3.

 

Анализ клинических исходов ЭКО в группе женщин 40–42 лет не выявил статистически значимых различий между подгруппами (табл. 4). Тем не менее при культивировании эмбрионов в культуральной среде с пониженным содержанием лактата выявлены тенденции увеличения частоты клинической и биохимической беременности по сравнению с традиционным культивированием. Культивирование эмбрионов в низколактатной среде привело практически к двукратному увеличению частоты живорождения – до 11,4% – по сравнению с культивированием в классической среде, где данный показатель составил 5,7% (p=0,227); см. табл. 4.

 

На следующем этапе для оценки вклада возрастного фактора в исходы программ ВРТ проведен корреляционный анализ показателей гормонального исследования с клиническими исходами в группах женщин 35–39 и 40–42 лет. Поскольку статистически значимые межгрупповые различия выявлены только по уровню АМГ, проведен корреляционный анализ его уровня с частотой наступления клинической беременности с применением непараметрического метода ранговой корреляции по Спирмену. Анализ показал прямую положительную связь уровня АМГ с частотой наступления клинической беременности во второй когорте женщин 40–42 лет (r=0,18; p=0,036) и отсутствие такой связи в группе женщин 35–39 лет (p=0,877). Корреляционный анализ уровня АМГ с другими клиническими исходами, в том числе с частотой живорождения, не выявил связей.

Обсуждение 

Как известно, женщины старше 35 лет имеют сниженные показатели наступления беременности и живорождения, что связано не только с биологическим и овариальным старением, но и возрастанием соматической и гинекологической патологии. Для оптимизации программ ЭКО с целью улучшения исходов важное значение имеет изучение клинических и анамнестических данных. В нашем исследовании межгрупповой анализ клинико-анамнестических характеристик в возрастных когортах 35–39 и 40–42 лет не выявил статистически значимых различий, что позволило предположить отсутствие роли данных факторов в исходах программ ВРТ. Женщины из группы 2 (40–42 лет) по сравнению с женщинами из группы 1 (35–39 лет) не отличались более высокой частотой патологий соматического и акушерско-гинекологического анамнеза.

На исходы программ ВРТ преимущественное влияние оказывают такие факторы, как возраст, качество эмбрионов, ответ на овариальную стимуляцию, частота формирования бластоцист и их качество. На следующем этапе исследования проведен анализ клинических исходов программ ВРТ при культивировании эмбрионов в классической культуральной среде и среде с пониженным содержанием лактата в обеих возрастных группах. В группе женщин 35–39 лет значимых различий в показателях овариальной стимуляции и эмбриологического этапа не получено. Закономерным было отсутствие и достоверных различий в клинических исходах ЭКО у данной возрастной группы. Однако анализ показателей эмбриологического этапа у пациенток 40–42 лет выявил статистически значимые различия в виде увеличения частоты формирования бластоцист и количества полученных бластоцист при культивировании эмбрионов в низколактатной культуральной среде по сравнению с классической. Закономерно, что в группе женщин 35–39 лет по сравнению с пациентками 40–42 лет требовались более низкие дозы гонадотропинов в протоколе овариальной стимуляции, а также было получено большее количество ОКК, зрелых ооцитов, зигот с двумя пронуклеусами 2PN и бластоцист. Эти данные демонстрируют высокую значимость возрастного фактора даже на небольших выборках.

Полученные достоверные различия в результатах эмбрионального этапа между двумя возрастными группами требуют исследования реализуемых патологических механизмов. Развитие омиксных технологий позволяет расширять знания о метаболических изменениях при бесплодии и, соответственно, уточнять различные аспекты его патофизиологии. При развитии патологических состояний, в том числе овариального старения, отмечается изменение состава фолликулярной жидкости, а также окружающего эмбрион микроокружения [13]. В исследовании H. Kobayashi и соавт. (2024 г.) показано, что продукция метаболитов в фолликулярной жидкости происходит в результате активации пяти метаболических путей: гликолиза, окислительного фосфорилирования, липидного метаболизма и β-окисления жирных кислот, синтеза нуклеиновых кислот и кетогенеза [14]. В результате исследования авторы выделили определенный метаболомный профиль при старении, который характеризуется компенсаторным усилением гликолиза и липидного метаболизма в ответ на возрастающую митохондриальную дисфункцию [14]. J. Fiscus и соавт. (2024 г.) показали, что в фолликулярной жидкости при различных патологических процессах наблюдаются определенные сигнатуры метаболического профиля [15]. Так, при снижении овариального резерва отмечены уменьшение концентрации глюкозы и закономерное повышение лактата и пирувата [15]. Кроме того, важное значение для энергетического обмена ооцитов оказывает состав ферментов фолликулярной жидкости. В исследовании G. Collodel и соавт. (2023 г.) показано, что снижение овариального резерва сопряжено с уменьшением активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [16]. Результаты данных исследований являются следствием условий метаболизма в ооцитах, согласно которым высокие концентрации лактата приводят к снижению активности ЛДГ, что является критическим фактором для обеспечения нормального энергетического баланса [17, 18]. Как следует из приведенных исследований, метаболические нарушения сопряжены с поздним репродуктивным возрастом, однако их воздействие имеет важное значение не только на созревание ооцитов, но и на раннее эмбриональное развитие. В исследовании показано достоверное улучшение показателей эмбрионального этапа при культивировании эмбрионов в условиях низкого содержания лактата у женщин 40–42 лет, которые характеризуются наиболее высокими показателями метаболического стресса. Высокие концентрации лактата приводят к снижению активности ЛДГ, обеспечивающей преобразование лактата в пируват, который является источником продукции главного энергетического субстрата – аденозинтрифосфата [17, 18]. По-видимому, обеспечение эмбриона окружением с пониженным уровнем лактата в данной возрастной когорте обеспечивает лучшие условия культивирования ввиду компенсации исходных метаболических нарушений. Необходимо продолжить исследования с целью оценки эффективности данной культуральной среды на больших группах, а также изучения метаболических изменений, сопровождающих эмбриональное развитие у женщин указанной возрастной когорты.

Внимания заслуживают результаты проведенного корреляционного анализа уровня АМГ с исходами ВРТ, который выявил положительную связь данного показателя с частотой наступления клинической беременности в группе 1 (r=0,18; p=0,036). Полученные результаты частично совпадают с данными других работ. Так, X. Dai и соавт. (2020 г.) провели оценку значимости АМГ в исходах программ ВРТ у женщин старше 37 лет и показали ограниченную роль данного гормона в прогнозировании потенциала развития эмбриона in vitro и отсутствие какой-либо значимости в прогнозировании потенциала развития эмбриона in vivo [19]. Тем не менее, согласно полученным результатам, частота наступления беременности в группе с низким уровнем АМГ была значительно ниже, чем в группе с высоким уровнем, хотя это и не приводило к увеличению частоты живорождения [19]. Важное значение имеют результаты систематического обзора и метаанализа 2023 г. N. Li и соавт. (2023 г.), который показал, что уровень АМГ имеет высокую прогностическую ценность в отношении живорождения у женщин позднего репродуктивного возраста [20].

Заключение

Результаты приведенного исследования дают обнадеживающие перспективы для пациенток возрастной группы 40–42 лет, поскольку улучшение показателей эмбрионального этапа при культивировании эмбрионов в среде с пониженным содержанием лактата может повысить показатели кумулятивной частоты живорождения. Кроме того, полученные тенденции увеличения частоты наступления клинической беременности и живорождения в расчете на перенос эмбриона у женщин 40–42 лет при культивировании эмбрионов в низколактатной среде являются основой для продолжения исследования и его расширения с целью оценки эффективности данной модификации эмбриологического этапа.

Раскрытие конфликта интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Л.В. Хачатрян – методология, исследование, формальный анализ, курация данных, написание – первоначальный вариант, визуализация; В.Ю. Смольникова – концептуализация, методология, исследование, курация данных, надзор; Н.П. Макарова – методология, ресурсы, исследование, курация данных; А.П. Сысоева – ресурсы, исследование; Е.В. Кулакова – ресурсы, исследование, проверка; Е.А. Калинина – управлением проектом, исследование, надзор, написание – рецензирование и редактирование.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. L.V. Khachatryan – methodology, investigation, formal analysis, data curation, writing – original draft preparation, visualization; V.Iu. Smol'nikova – conceptualization, methodology, investigation, data curation, supervision; N.P. Makarova – methodology, resources, investigation, data curation; A.P. Sysoeva – resources, investigation; E.V. Kulakova – resources, investigation, validation; E.A. Kalinina – project administration, investigation, supervision, writing – review & editing.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Раскрытие информации об использовании ИИ. При написании статьи ИИ не использовался. 

Disclosing the use of AI. No AI was used when writing the article.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет); протокол №22-25 от 30.10.2025. Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской декларации.

Compliance with the principles of ethics. The study protocol was approved by the local ethics committee of Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); minutes №22-25 dated 30.10.2025. Approval and protocol procedure was obtained according to the principles of the Declaration of Helsinki.

Информированное согласие на публикацию. Пациентки подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

About the authors

Lia V. Khachatryan

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: leahkhachatryan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4867-500X

Graduate Student

Russian Federation, Moscow, Russian Federation

Veronika Iu. Smol'nikova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: leahkhachatryan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4866-8002

D. Sci. (Med.), Assoc. Prof.

Russian Federation, Moscow, Russian Federation

Natalya P. Makarova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: leahkhachatryan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1396-7272

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow, Russian Federation

Anastasia P. Sysoeva

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: leahkhachatryan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6502-4498

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow, Russian Federation

Elena V. Kulakova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: leahkhachatryan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4433-4163

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow, Russian Federation

Elena A. Kalinina

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: leahkhachatryan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8922-2878

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files