Комплексная диагностика состояния эндометрия у женщин с бесплодием и внутриматочной патологией с использованием иммуногистохимических маркеров

Полный текст

Проблема бесплодия является важной составляющей частью современной медицины. Согласно данным эпидемиологических исследований частота бесплодия в разных странах мира колеблется от 8 до 18% [1-6]. Доля бесплодных браков на территории России составляет 8-17,5% и не имеет тенденции к снижению [7, 8]. К числу наиболее часто встречающихся нозологических форм, входящих в структуру бесплодного брака, наряду с трубно-перитонеальным фактором (70%) и эндометриозом (46,5%), относятся так называемые маточные формы бесплодия (50%) [9, 10]. В основе патогенеза бесплодия при поражении матки лежит нарушение процесса имплантации эмбриона на стадии бластоцисты, происходящего в середине лютеиновой фазы (19-24-й день менструального цикла - МЦ) [11]. На сегодняшний день существует достаточно большое количество различных современных высокоинформативных диагностических методов исследования, однако в данной работе помимо стандартных методик мы использовали иммуногистохимическое (ИГХ)-исследование эндометрия у женщин с бесплодием и внутриматочной патологией. Целью исследования явилась морфологическая и ИГХ-оценка состояния эндометрия у женщин с бесплодием и внутриматочной патологией. Материалы и методы В Клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф.Снегирева ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М.Сеченова» за период с 2012 по 2014 г. было проведено обследование 100 женщин с нарушением репродуктивной функции в возрасте от 27 до 42 лет. Пациентки были разделены на 3 группы: 1-я - 46 женщин, у которых диагностирована гиперплазия эндометрия, 2-я - 35 женщин с внутриматочными синехиями, 3-я - 19 женщин с хроническим эндометритом. Критерием отбора больных для исследования являлись отсутствие беременности, наличие внутриматочной патологии. Общеклинические методы включали: клиническое и биохимическое исследование крови, общий анализ мочи, микроскопическое и бактериологическое исследование флоры из цервикального канала и влагалища. Инструментальные методы исследования включали: кольпоскопию, гистеросальпингографию (ГСГ), трансвагинальное ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза, гистероскопию, биопсию эндометрия с последующими морфологическим и ИГХ-исследованием соскобов. Трансвагинальное УЗИ осуществлялось на ультразвуковом аппарате Toshiba SSH-140A с трансвагинальным конвексным датчиком с частотой 6,5 МГц. Оценивали размеры матки, наличие аномалий развития и деформации матки, структуру миометрия, толщину эндометрия, размеры и структуру яичников, наличие желтого тела и фолликулов. При наличии патологических образований оценивали размеры, количество, локализацию, структуру и эхогенность. r22-1.jpg Всем пациенткам с подозрением на внутриматочную патологию производилась «офисная» гистероскопия на 5-9-й день МЦ. Использовали офисный гистероскоп со световолоконной оптикой фирмы Karl Storz, диаметром 2,7 мм без применения пулевых щипцов и расширения цервикального канала. Оценивали состояние слизистой цервикального канала, стенок полости матки и эндометрия, толщину, рельеф, окраску и состояние устьев маточных труб. ГСГ проводилась некоторым женщинам дополнительно с целью уточнения состояния маточных труб. Морфологическое и ИГХ-исследование биоптатов проводилось в межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М.Сеченова». Для гистологического исследования соскобы эндометрия и ткани фиксировали в 10% забуференном (фосфатном) нейтральном формалине и заливали в парафин. Суммарное время фиксации и заливки материала не превышало 24 ч. Затем с каждого блока делали не менее 10 ступенчатых срезов толщиной 4 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином. В окрашенных препаратах оценивали состояние желез эндометрия и стромы, наличие фиброза, воспалительной инфильтрации, количество и калибр спиральных артерий, толщину их стенок. Для ИГХ-исследования использовали двухэтапный с демаскировкой антигена стрептавидин-биотин-пероксидазный метод с применением стандартных наборов моноклональных антител фирмы Dako. На парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой антигенов в СВЧ-печи с использованием соответствующих стандартных антител выявляли следующие маркеры: рецепторы к эстрогенам и прогестеронам, Кi-67, CD34, CD56, CD68, CD 138, эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF). Проявление реакции осуществлялось системой визуализации Dako Cytomation. Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex). r22-2.jpg Результаты реакции рецепторов к эстрогенам и прогестеронам идентифицировались по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой процента окрашенных клеток и интенсивностью окраски клеток. Экспрессию рецепторов к эстрогенам и прогестеронам оценивали по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени). Для оценки уровня экспрессии антигена Ki-67 в железах подсчитывался индекс пролиферации - отношение количества окрашенных ядер клеток к общему числу ядер в процентах при подсчете не менее 300 ядер. Экспрессия Ki-67 в строме оценена путем подсчета количества окрашенных ядер в поле зрения при увеличении 400, при этом изучали не менее 10 полей зрения. Экспрессию CD34 и VEGF определяли в эпителии, строме эндометрия и эндотелии сосудов. Активность проявлялась в виде окрашивания мембраны и цитоплазмы эпителиальных и эндотелиальных клеток. Результаты оценивали полуколичественно, по общепринятой методике: + - до 20% положительных клеток - 2 балла; ++ - 20-40% положительных клеток - 4 балла; +++ - больше 40% положительных клеток - 6 баллов. Экспрессию CD56, CD68, CD138 оценивали путем подсчета позитивных клеток в поле зрения при увеличении 400 (при подсчете не менее 10 полей зрения). Статистическая обработка материала проводилась с использованием стандартной программы Microsoft Excel 2010. В данном исследовании использовался метод подсчета с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена, где p - выборочный коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Значимость коэффициента ранговой корреляции - уровень 0,05. Результаты исследования r22-3.jpg Клинико-анамнестические данные 100 женщин с нарушением репродуктивной функции позволили выявить у 62 из них первичное бесплодие, а у 38 - вторичное. Длительность бесплодия составляла 5,5±0,5 и 3,2±0,7 года соответственно в группах с первичным и вторичным бесплодием. При изучении акушерско-гинекологического анамнеза только у 19 (50%) из 38 пациенток с вторичным бесплодием в анамнезе были роды. Одни роды в анамнезе были у 17 (44,7%) женщин, двое родов - у 9 (23,6%). Искусственное прерывание беременности было проведено 23 (60,5%) женщинам, у 15 (39,4%) из них - более 2 раз. Самопроизвольные выкидыши в анамнезе отмечались у 11 (28,9%) женщин, у 6 (15,7%) из них - более 3 раз. У пациенток всех групп с первичным и вторичным бесплодием в анамнезе имели место гинекологические оперативные вмешательства. Частота разных гинекологических оперативных вмешательств у больных с первичным и вторичным бесплодием представлена на рис. 1. Осмотр шейки матки в зеркалах в 8 (8%) случаях позволил выявить рубцовую деформацию шейки матки, в 10 (10%) - эктопию шейки матки. Указанные данные были подтверждены и дополнены результатами, полученными при расширенной кольпоскопии. ГСГ была произведена 60 (60%) женщинам из 100 (100%) обследованных пациенток, 40 (40%) женщинам ГСГ не проводилась, они были обследованы по поводу бесплодия ранее в отделениях вспомогательных репродуктивных технологий перед экстракорпоральным оплодотворением (ЭКО) и переносом эмбрионов (ПЭ). Из 60 (100%) женщин у 21 (35%) ГСГ выявила дефект наполнения полости матки от частичной до полной облитерации, что позволило диагностировать наличие внутриматочных синехий. При трансвагинальном УЗИ, которое проводилось в I фазу МЦ, у большинства пациенток отмечались повышенная эхогенность, неоднородность структуры эндометрия с множественными мелкими анэхогенными включениями. При офисной гистероскопии у 46% женщин определялись неровность поверхности слизистой оболочки, ярко-красный цвет, сосудистый рисунок резко выражен, устья маточных труб визуализируются, свободны. У 7% пациенток полость матки была облитерирована полностью, внутриматочные синехии деформировали 2/3 полости у 4% женщин, у 5% внутриматочные синехии визуализировались в области трубных углов и 19% - в виде единичных тяжей. У 19% отмечалась гиперемия, стенки легкоранимы, при малейшем прикосновении кровоточат, островки белесоватого или желтоватого цвета, гипертрофированная отечная слизистая оболочка матки. r22-4.jpg При гистероскопии всем пациенткам проводилась биопсия эндометрия с последующим гистологическим исследованием, а 59 пациенткам проведено и ИГХ-исследование. По результатам гистологического и ИГХ-исследования эндометрия были отобраны и сформированы 4 группы: 1-я - с гиперплазией эндометрия (n=25), 2-я - с внутриматочными синехиями (n=17), 3-я - с хроническим эндометритом (n=10), 4-я - эндометрий фазы пролиферации (n=7). Морфологическая картина в 1-й группе соответствовала простой гиперплазии эндометрия без атипии. Отмечалось повышение количества как железистых, так и стромальных элементов. Однако отсутствовало заметное тесное расположение желез. Железы округлые и разнообразные по величине (рис. 2). Морфологическая картина во 2-й группе соответствовала диагнозу «внутриматочные синехии», эндометрий фазы пролиферации, строма эндометрия в значительной степени заменена фиброзной тканью, железы представлены неактивным призматическим эпителием эндометриального типа, аваскулярные ткани, кальцификация стромы и железы. Морфологическая картина в 3-й группе соответствовала хроническому эндометриту, эндометрий фазы пролиферации. Отмечалось наличие множественных воспалительных инфильтратов, состоящих преимущественно из плазматических клеток и лимфоидных элементов. Очаговые инфильтраты имели вид лимфоидных фолликулов и располагались не только в базальном, но и во всех отделах функционального слоя эндометрия, в состав их входили лейкоциты и гистиоциты (рис. 3). Склеротические изменения стенок спиральных артерий эндометрия и очаговый фиброз стромы свидетельствуют о длительном хроническом воспалении. Морфологическая картина в 4-й группе - эндометрий соответствовал фазе пролиферации, железы мелкие, расположены равномерно, строма рыхлая, сосуды многочисленные с тонкими стенками (рис. 4). Результаты ИГХ-исследования эндометрия у пациенток всех групп представлены в таблице. t22.jpg У пациенток всех групп выявлена неравномерная низкая пролиферативная активность, отмечалось снижение уровня экспрессии Ki-67 как в эпителии желез, так и в клетках стромы (р<0,05), что может свидетельствовать о наличии неполноценного «окна имплантации». При сравнении экспрессии рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PR) достоверных различий в 1, 2 и 4-й группах выявлено не было. В ходе исследования обнаружено, что показатели ER:PR в стадии пролиферации были практически равны 1 (р<0,05). Индекс экспрессии ER и PR в группе с хроническим эндометритом составил 77,8 и 74,2% соответственно (р>0,05), отмечалось отклонение от нормы в сторону понижения, что свидетельствует о нарушении синтеза ER и PR железистых и стромальных клеток. Таким образом, эндометрий становится слабо восприимчив к эстрогену и прогестерону. Отмечалось снижение числа основных иммунокомпетентных клеток эндометрия (CD56-позитивных клеток) во всех группах (р<0,05), что проявлялось низкой цитотоксической активностью и снижением макрофагов СD68 в эндометрии (р<0,05), тогда как считается, что для обеспечения нормального процесса имплантации количество этих клеток в I фазу МЦ должно повышаться (рис. 5). r22-5.jpg Анализ показателей маркера плазматических клеток CD138 показал, что его уровень экспрессии у пациенток 1-й группы невысокий, а в эндометрии у пациенток 2 и 4-й групп экспрессия CD138 отсутствует (р<0,05). Это свидетельствует о незначительных воспалительных изменениях в эндометрии у пациенток 1-й группы и отсутствии воспалительных процессов у пациенток 2 и 4-й групп. Полученные данные маркера плазматических клеток CD138 свидетельствуют о незначительной роли воспалительных изменений эндометрия в нарушении имплантации у пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия и внутриматочными синехиями, тогда как у пациенток с хроническим эндометритом повышенная экспрессия маркера плазматических клеток CD138 является фактором, препятствующим имплантации, и свидетельствует о наличии воспалительных изменений эндометрия. Экспрессия CD34 (маркер, отвечающий за ранние этапы кроветворения) во всех группах проявлялась позитивной интенсивной реакцией в эндотелии спиральных артерий, многочисленных капиллярах и клетках стромы, что свидетельствует о том, что сосуды закладываются нормально, идет нормальная пролиферация эндотелиоцитов (р<0,05). Однако в 4-й группе отмечались превосходящие показатели для данной фазы МЦ (пролиферации), что может свидетельствовать о том, что идет повышенный процесс пролиферации эндотелиоцитов в базальном слое и строме эндометрия. В норме нарастание экспрессии CD34 в базальном слое и строме эндометрия отмечается во II фазе цикла. Таким образом, у пациенток 4-й группы можно предположить низкую вероятность фиброза эндотелиоцитов, что не исключает наличия его у пациенток 1, 2 и 3-й групп. Экспрессия VEGF в 1 и 3-й группах (р<0,05) проявлялась позитивной реакцией в отдельных клетках стромы и эндотелии сосудов, что говорит о снижении процессов неоангиогенеза, свидетельствует о недостаточном кровоснабжении и ведет к гипоксии вследствие уменьшения диффузии кислорода. Низкий VEGF приводит к бедному сосудообразованию, которое в дальнейшем еще более уменьшает сосудистый кровоток в эндометрии. Экспрессия VEGF в 4-й группе проявлялась позитивной реакцией во всех клетках стромы и эндотелии сосудов. Однако во 2-й группе экспрессия VEGF отсутствовала, что свидетельствует о нарушениях процессов неоангиогенеза. Заключение Включение в комплексное обследование женщин с бесплодием и внутриматочной патологией ИГХ-методик позволяет провести полноценную оценку состояния эндометрия. Нарушение процесса имплантации может быть связано с низким содержанием иммунокомпетентных клеток CD56 и макрофагов СD68, а также со снижением процессов неоангиогенеза и последующей гипоксией тканей. Низкий уровень экспрессии Ki-67 свидетельствует о низкой пролиферативной активности эндометрия, что может также являться препятствием для имплантации. Таким образом, определение в эндометрии ИГХ-показателей может служить дополнительным критерием для оценки «имплантационной» функции.

Об авторах

Нарина Анатольевна Арутюнян

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Email: narinaarutyunyan@yandex.ru
аспирант каф. акушерства и гинекологии №1 лечебного фак-та ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Теа Амирановна Джибладзе

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Email: djiba@bk.ru
д-р мед. наук, проф. каф. акушерства и гинекологии №1 лечебного фак-та ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Владимир Михайлович Зуев

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Email: vlzuev@bk.ru
д-р мед. наук, проф. каф. акушерства и гинекологии №1 лечебного фак-та ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Анатолий Иванович Ищенко

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Email: 7205502@mail.ru
д-р мед. наук, проф., зав. каф. акушерства и гинекологии №1 лечебного фак-та ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Дмитрий Викторович Брюнин

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Email: bryun777@mail.ru
д-р мед. наук, доц. каф. акушерства и гинекологии №1 лечебного фак-та ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Ирина Дмитриевна Хохлова

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Email: irhohlova5@gmail.com
канд. мед. наук, доц. каф. акушерства и гинекологии №1 лечебного фак-та ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Ирина Викторовна Гадаева

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Email: gadaeva-gin@gmail.com
канд. мед. наук, доц. каф. акушерства и гинекологии №1 лечебного фак-та ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Арчил Александрович Сиордия

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Email: siordiya.archil@icloud.com
канд. мед. наук, доц. каф. акушерства и гинекологии №1 лечебного фак-та ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Список литературы

Дополнительные файлы