Diagnostic significance of markers of inflammation in the cervical canal in pregnant women with bacterial vaginosis

Full Text

В развитии бактериального вагиноза (БВ) иммунная система играет определяющую роль. Иммунная система женских половых органов осуществляет основную линию локальной защиты от патогенов. Нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты слизистой оболочки синтезируют цитокины, секреторные иммуноглобулины и другие биологически активные молекулы. Исследование цервикальной слизи перспективно в плане поиска методов неинвазивной диагностики. Для определения биологически активных молекул в цервикальной слизи используется метод экстракции, при этом стандартизация полученных данных проводится разными методами [1-3]. Для БВ характерно отсутствие признаков воспаления, в том числе лейкоцитарной реакции. Однако наблюдаемое при БВ патологическое изменение равновесия влагалищных микроорганизмов приводит к их адгезии к слизистой оболочке вследствие измененной рецепторной активности влагалищного эпителия. Вытеснение лактобактерий при БВ способствует формированию среды с высокой вирулентностью, что может отрицательно сказываться на развитии беременности и течении родов. Поэтому важно изучение местного иммунитета у беременных для совершенствования профилактики и лечения БВ во время беременности. Так, сравнение эндоцервикального уровня провоспалительных цитокинов интерлейкина (ИЛ)-1, ИЛ-6, ИЛ-8 у беременных и небеременных пациенток с БВ и одинаковым соматическим статусом в обеих группах показало, что у беременных уровень цитокинов был значительно выше, чем у небеременных, что, возможно, связано с иммунным компромиссом во время беременности [4-8]. Преобладание дисбиотических изменений в микрофлоре влагалища и персистенция микроорганизмов в цервикальном канале у беременных с привычным невынашиванием приводят к достоверному превышению провоспалительных цитокинов фактора некроза опухоли a (ФНО-a), интерферона-g (ИФН-g), ИЛ-6 над регуляторными ИЛ-4, ИЛ-10 в противоположность здоровым беременным [9]. В популяции беременных с преждевременным разрывом плодных оболочек в сроке менее 34 нед при амниоцентезе исследованы внутриматочная микрофлора и цитокины ИЛ-6, ИЛ-8. Бактериальная флора в амниотической жидкости обнаружена у 25% беременных. Концентрация в водах ИЛ-6>0,80 нг/мл ассоциировалась с внутриматочной инфекцией и высоким риском наступления преждевременных родов в ближайшие 7 дней, а повышение концентрации ИЛ-8 указывало на роды ранее 34 нед [10]. Полученные данные сочетаются с другими аналогичными исследованиями, свидетельствующими о том, что низкие концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1a, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 в цервикальном отделяемом в сроки гестации 22-34 нед, особенно уровень ИЛ-8, представляют высокий риск раннего инфекционного заболевания новорожденных. Среди других маркеров преждевременных родов исследование содержания ИЛ-6 в вагинальном отделяемом позволит идентифицировать беременных с высоким риском неонатальной инфекции и прогнозировать наступление родов ранее 34 нед гестации [11]. По некоторым данным, уровни ИЛ-1, ИЛ-6 в вагинальном отделяемом были достоверно выше у беременных с БВ [12]. Другое исследование, касающееся частоты выявления 7 провоспалительных цитокинов и полиморфизма гена Toll-подобного рецептора у беременных с наличием и отсутствием БВ при сроке гестации менее 30 нед, показало, что полиморфизм на выделенных локусах ИЛ-1a, ИЛ-6, ИЛ-8 связан с изменением степени выраженности БВ при беременности [4]. Для клинических вариантов заболеваний, вызванных вагинальной оппортунистической инфекцией, необходимо использовать иммунологические факторы, которые могли бы быть объективными маркерами в оценке эффективности лечения. Поскольку цитокины являются ключевыми факторами в фазах индукции и развития иммунного ответа, то количественное определение их содержания в секреторных компонентах репродуктивного тракта имеет большое значение [13]. Целью настоящего исследования было определение в отделяемом цервикального канала провоспалительных и противовоспалительных цитокинов как показателей состояния местного иммунитета у беременных с БВ. Материал и методы В исследование были включены 45 беременных, обратившихся в ранние сроки гестации. Основную группу составили 32 беременные, у которых был верифицирован диагноз БВ, группу сравнения - 13 беременных с нормальным микробиоценозом влагалища. Уровень цитокинов в отделяемом цервикального канала определяли в I триместре беременности до лечения БВ, затем повторяли после лечения в 22-23 и в 33-34 нед гестации. В эти же сроки определяли содержание цитокинов в отделяемом цервикального канала и у пациенток контрольной группы. Оценку состояния микробиоценоза влагалища проводили на основании микроскопии вагинальных мазков, окрашенных по Граму, и культурального исследования вагинального содержимого на факультативно-анаэробные бактерии, дрожжеподобные грибы, генитальные микоплазмы. Степень микробной обсемененности влагалища определяли методом секторного посева отделяемого влагалища на 5% кровяной агар, среду Сабуро и МРС. Видовую идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами. Микробиологическая диагностика БВ при микроскопии вагинальных мазков базировалась на следующих критериях: наличие ключевых клеток; отсутствие выраженной лейкоцитарной реакции; массивное микробное обсеменение с преобладанием морфотипов облигатно-анаэробных бактерий (бактероидов, мобилункуса, фузобактерий, лептотрихий) и гарднереллы; отсутствие или выявление единичных в поле зрения грамположительных палочек морфотипа лактобактерий. Слизь из цервикального канала брали универсальным зондом, спонж со слизью отделяли ножницами и помещали в пробирку типа Эппендорф с 1 мл буфера, содержащего 5 мм3 этилендиаминтетрауксусной кислоты, 10 мм3 трисгидроксиметиламинометана, 1% бычьего сывороточного альбумина и немедленно 0,5 мм3 ингибитора протеиназ (РМ5Р) в 100 мл дистиллированной воды, рН 7,4. Затем проводили экстракцию встряхиванием на вортексе в течение 1 мин. Смесь центрифугировали в течение 5 мин при 900 g и отбирали надосадочную жидкость, которую немедленно замораживали и хранили до анализа при -80°С. В слизи цервикального канала определяли содержание провоспалительных (ФНО-a, ИФН-g, ИЛ-1a, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10) методом иммуноферментного анализа. Для проведения анализа использовали наборы фирмы «Цитокин» (Санкт-Петербург). Количественное содержание цитокинов в цервикальной слизи нормировали путем пересчета на общий белок в пробах. Определение белка в пробах проводили колориметрическим методом с помощью бицинхониновой кислоты (Sigma, США). Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методам вариационной статистики. Значимость наблюдаемых отклонений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты и обсуждение Данные о содержании цитокинов в цервикальной слизи беременных в разные сроки гестации представлены в таблице. Как видно из таблицы, имелись достоверные различия в содержании цитокинов в отделяемом цервикального канала в I триместре у беременных с БВ и у беременных с нормальным микробиоценозом влагалища: уровни как про-, так и противовоспалительных цитокинов в основной группе в 2 раза и более превышали аналогичные показатели в группе сравнения. Анализ изменений содержания цитокинов в цервикальной слизи в группе пациенток с нормомикробиоценозом влагалища показал, что в I триместре беременности практически все исследованные цитокины количественно характеризуются минимальными значениями. Далее при отсутствии достоверных различий обнаруживаются разные тенденции в изменении содержания исследованных цитокинов в последующие триместры (за исключением ИЛ-10, уровень которого достоверно повышается в III триместре по сравнению с содержанием в I триместре). Однако, несмотря на это, очевидно, что при нормомикроцинозе влагалища локальные иммунные реакции проявляют тенденцию к поддержанию некоторой постоянной концентрации секретируемых цитокинов в течение всего срока беременности. Это несколько отличается от картины, описываемой рядом исследователей относительно содержания этих цитокинов в крови женщин при физиологической беременности, в том числе и не осложненной БВ [1, 14]. По наблюдениям этих авторов, в крови женщин при физиологической беременности наблюдаются признаки воспалительной реакции с повышением содержания ряда цитокинов. Вероятно, это различие объясняется адекватным функционированием гистогематического барьера и, как следствие, созданием наиболее благоприятных условий для развивающейся беременности. При обследовании женщин во II и III триместрах беременности достоверное различие в содержании цитокинов между группами отсутствовало. Исключение составили ИЛ-6 и ИЛ-2. Следует отметить, что после лечения БВ микрофлора влагалища у беременных основной группы по данным микробиологического обследования соответствовала показателям у здоровых беременных. Достоверное снижение уровня ряда цитокинов у беременных основной группы в динамике беременности, за исключением уровней ФНО-a и ИЛ-8, возможно, также связано с отсутствием выраженного воспаления слизистой влагалища при БВ, следствием которого могло бы быть изменение опосредуемого данными цитокинами активного синтеза адгезивных молекул и киллерной активности фагоцитирующих клеток. Известно также, что существует антагонистическое взаимодействие между ФНО-a и ИЛ-6. Повышение продукции ФНО-a в I триместре приводит к усилению выработки ИЛ-6. Однако стабильно повышенные концентрации ИЛ-6 во II и III триместрах беременности вызывают уменьшение секреции ФНО-a и, как следствие, подавление миграции лейкоцитов в ткань. Детальный анализ динамики цитокинов по триместрам в основной группе беременных показал, что изменение содержания ИФН-g, ИЛ-1a, ИЛ-8 и ИЛ-10 имеет следующую тенденцию: повышенное содержание в I триместре, снижение во II триместре (после лечения) и вновь повышение содержания в цервикальной слизи в III триместре беременности. Причем отмечается, что при достоверном снижении их концентрации после лечения средние значения содержания ИФН-g, ИЛ-8, ИЛ-10, а также ИЛ-1a во II триместре беременности остаются повышенными по сравнению с аналогичными показателями в группе беременных с нормомикробиоценозом влагалища. Отсутствие достоверных различий между группами в содержании данных цитокинов дает право предположить, что изменения, вызванные патогенными микроорганизмами, а также произошедшие вследствие сдвига микроэкологических нитей в половых путях беременных, не являясь критическими для беременности, создают более высокий фоновый провоспалительный уровень. Следует отметить, что средние показатели содержания данных цитокинов в III триместре беременности в основной группе максимально приближены к значениям в группе сравнения. Также заслуживает внимания высокий уровень в цервикальной слизи ИЛ-1a. Известно, что ИЛ-1a представляет собой трансмембранный белок, в свободной форме он находится внутри клетки и секретируется при разных патологических состояниях. Обнаружение его в биологических жидкостях организма говорит об активации макрофагального звена иммунитета. Выявленный в данном исследовании уровень секреторной формы ИЛ-1a у беременных основной и контрольной групп свидетельствует об антигенной стимуляции бактериальными продуктами. Особенно активно по мере увеличения срока беременности у пациенток с БВ снижались уровни ИЛ-6, ИФН-g, ИЛ-2. В то же время обращает на себя внимание достоверное повышение концентрации противовоспалительного цитокина ИЛ-10 у здоровых беременных в поздние сроки гестации, что, возможно, обусловлено изменением состояния иммунной системы организма перед родами. Важным свойством ИЛ-10 является подавление активности иммунных клеток, что приводит к завершению воспалительной реакции, элиминации патогена и восстановлению структуры поврежденной ткани [15]. Высокое содержание ИЛ-10 при БВ в I триместре беременности, вероятно, связано с реализацией регуляторной функции на фоне активной продукции провоспалительных цитокинов. Следует отметить, что из всех исследованных цитокинов особого внимания заслуживает ИЛ-6, точнее, характер изменения его содержания. Динамика его при нормомикроценозе совпадает с динамикой при БВ, однако становится очевидным его повышенное содержание у беременных с БВ во всех триместрах беременности. Известно, что ИЛ-6 вырабатывается различными клетками, в том числе децидуальными клетками и амниоцитами, и является маркером внутриутробного инфицирования [10]. Однако перинатальные исходы у женщин с БВ не отличались от таковых в контрольной группе. Повышенный уровень провоспалительных цитокинов в цервикальном секрете наблюдается у женщин с привычным невынашиванием беременности. Обнаружение выраженных отличий в содержании этого цитокина в цервикальном секрете, по нашим данным, не означает наличия внутриутробной инфекции. Результаты, полученные при определении ИЛ-2 и ИЛ-4 в цервикальной слизи при БВ, свидетельствуют о достоверном снижении содержания обоих цитокинов после лечения с сохранением минимальных концентраций к родам. О достоверных отличиях между группами и динамике ИЛ-2 и ИЛ-4 при нормомикроценозе влагалища говорить сложно в связи с малым числом исследований этих цитокинов в данной группе беременных. Таким образом, анализ полученных результатов показал, что содержание про- и противовоспалительных цитокинов в отделяемом цервикального канала у беременных с БВ достоверно выше, чем в группе сравнения, на этапе, предшествующем медикаментозному лечению. Наблюдаемая при данной патологии потеря функции влагалища проявляется в активации местного иммунитета с секрецией молекул, оказывающих аутокринное, паракринное и эндокринное влияние. Выявление данных молекул в цервикальной слизи не означает, что они активны в ней. Вероятно их опосредованное действие на клетки иммунной системы и рецепторный аппарат клеток, формирующих слизистую оболочку влагалища и эндоцервикса. При устранении защитного барьера, которым являются лактобактерии, создаются условия для несбалансированной продукции цитокинов и, как следствие, для формирования микросреды, в которой происходит изменение конечных продуктов обмена клеток, что сказывается на качестве и составе выделяемой слизи. Дисбиотические нарушения во влагалище приводят к снижению функционального резерва клеток и вследствие этого к изменению их метаболической активности. В свою очередь, изменение синтеза белка клетками эндоцервикса приводит к варьированию соотношения фракций растворимого и нерастворимого коллагена в тканях и в итоге к изменению (ухудшению) биомеханических свойств шейки матки [14]. Считается, что нарушенный баланс микрофлоры влагалища может спонтанно нормализоваться без назначения корригирующей терапии. Однако возникающее при беременности состояние иммуносупрессии, которое обусловливает иммунную толерантность матери к аллоантигенам плода, способствует активации латентной инфекции и условно-патогенной микрофлоры, присутствующей во влагалище. В большинстве случаев системные эффекты, возникающие вследствие развития восходящей инфекции, в отношении внутренних половых органов и органов малого таза не находят развития. Но развиваются локальные иммунные реакции, центральным звеном которых является цитокиновый каскад [16]. Качественные и количественные изменения в уровнях цитокинов отражают степень активации иммунокомпетентных клеток при любом патологическом процессе. Полученные в данном исследовании результаты отражают определенную автономность иммунных реакций в нижних отделах половых путей женщины. Сведения об авторах

About the authors

T E Karapetian

V.I.Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: tomamed02@mail.ru
117997, Russian Federation, Moscow, ul. Akademika Oparina, d. 4

N A Lomova

V.I.Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: n-lomova@yandex.ru
117997, Russian Federation, Moscow, ul. Akademika Oparina, d. 4

M I Kesova

V.I.Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: mkesova@yandex.ru
117997, Russian Federation, Moscow, ul. Akademika Oparina, d. 4

References

Supplementary files