Potential predictive marker of treatment effectiveness in patients with osteopenic syndrome after surgical menopause

Full Text

Введение

В настоящее время существует ряд эффективных методов лечения остеопороза, которые повышают минеральную плотность костной ткани (МПКТ) и снижают риск переломов. Однако не существует четкого консенсуса относительно оптимального метода оценки ответа на лечение у отдельного пациента. Целью лечения остеопороза является предотвращение переломов после минимальной травмы, но это относительно редкие события и их нельзя полностью избежать с помощью доступных в настоящее время методов лечения. Альтернативные методы оценки ответа на лечение включают последовательное измерение МПКТ или биохимических маркеров обмена кости, но они являются суррогатными. Долю пациентов, которые не реагируют на лечение остеопороза, трудно определить количественно. Клинические испытания показывают продолжающуюся потерю костной массы у 15% женщин на фоне менопаузальной гормональной терапии (МГТ) или бисфосфонатов [1]. Отсутствие ответа на лечение, вероятно, чаще встречается в клинической практике, но может быть связано с недостаточным соблюдением рекомендаций по лечению. Другие потенциальные причины очевидной неспособности реагировать на лечение включают: низкое потребление кальция с пищей, недостаточность витамина D, качество лекарственного препарата [2] и индивидуальную чувствительность пациенток к терапии (плотность транспортеров и рецепторов-мишеней, ферментов метаболизма). Резервом повышения эффективности терапии/профилактики остеопороза, таким образом, является поиск маркеров прогноза эффективности препаратов среди перечисленных.

Цель исследования – поиск маркеров прогноза эффективности лечения остеопенического синдрома (ОС) у женщин после хирургической менопаузы среди мишеней лекарственной терапии – уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов и витамина D в мононуклеарах периферической крови.

Материалы и методы

В исследование включены 100 женщин с хирургической менопаузой, проживающих в Московской области, обратившихся и наблюдавшихся в отделении гинекологической эндокринологии ГБУЗ МО МОНИИАГ. Возраст обследованных пациенток колебался от 40 до 55 лет (48±1,2). Длительность хирургической менопаузы составила от 12 мес до 6 лет. Дополнительным критерием включения пациенток в исследование было отсутствие противопоказаний к применению МГТ. Критерии исключения: наличие болезней эндокринной системы (щитовидной железы, надпочечников), тяжелых экстрагенитальных заболеваний, способных вызвать развитие вторичного остеопороза; женщины, получавшие в предыдущие 6 мес МГТ; женщины, оперированные по поводу злокачественных опухолей любой локализации.

Всем женщинам произведено определение МПКТ методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (денситометр Hologic Discovery, США) в области поясничных позвонков, в трех точках проксимального отдела бедра (шейка бедра, трохантер, область Варда). Оценивали результаты по Т-критерию, который сравнивает результат МПКТ с пиковой массой (максимальной МПКТ, которую может накопить молодой здоровый индивид в идеальных условиях). После обследования пациенткам при необходимости назначали два варианта медикаментозного лечения. В 1-й группе (n=32) у 84% пациенток выявлен недостаток 25(ОН) витамина D (20,31±2,28 нг/мл) и у 6% – дефицит (9,7±0,3 нг/мл). Во 2-й группе (n=26) показатели были в норме (35,09±0,55 нг/мл). В зависимости от степени тяжести менопаузальных расстройств, кальций-фосфорных изменений и уровня витамина D пациенткам 1-й группы (гиповитаминоз) назначена МГТ в комбинации с препаратами кальция и витамином D и пациенткам 2-й группы – изолированно МГТ. Третью группу составили пациентки без ОС (n=42, контроль).

МГТ – преимущественно эстроген-гестагенные препараты (эстрадиол 1 мг, дидрогестерон 5 мг) подбирали индивидуально на основании клинических рекомендаций Минздрава России «Менопауза и климактерическое состояние у женщины» 2016 г. [3]. Пациентки 1-й группы дополнительно к МГТ получали препарат витамина D (колекальцеферол 1000 МЕ) и препарат кальция (кальция карбонат 1250 мг, колекальцеферол 400 МЕ 2 таблетки в сутки). Через 12 мес после старта терапии пациентки прошли повторное обследование. Эффективность терапии оценивали по данным МПКТ. По результатам анализа пациенток разделили на две группы: отвечающие на лечение (А) и не отвечающие на терапию (Б).

Перед началом лечения у пациенток забирали кровь и сразу выделяли мононуклеарную фракцию клеток (МНФК) по методу A. Boyum [4]. Выделение матричной РНК (мРНК) из МНФК проводили с помощью набора готовых реагентов «РИБО-преп» («АмплиСенс», Россия) согласно инструкции производителя. Образцы мРНК хранили до исследования в стабилизационном растворе в жидком азоте. Получение комплементарной ДНК на матрице мРНК проводили с помощью реакции обратной транскрипции с использованием комплекта реагентов РЕВЕРТА-L («АмплиСенс», Россия). Для полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) использовали набор готовых реактивов для ПЦР «Реакционная смесь 2,5x для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I» на приборе iCycler iQ5 real-time PCR (BioRad, Германия). В качестве контрольного гена использовали ген GAPDH. Последовательности праймеров искомых генов представлены в таблице.

 

Последовательности (5’-3’) праймеров рецепторов витамина D, эстрадиола, прогестерона и GAPDH для ПЦР Vitamin D, estradiol, progesterone and GAPDH receptor (5’-3’) primers sequences for polymerase chain reaction
	up	low
GAPDH	gaa-ggt-gaa-ggt-cgg-agt	gaa-gat-ggt-gat-ggg-att-tcc
VDR	gca-gag-tgt-gca-ggc-gat-tcg	tga-agc-tcg-tgt-tcc-ccg-caa-t
mER	agg-gac-aag-ctg-agg-ctg-ta	gtc-tac-acg-gca-ctg-ctg-aa
ERa	tgc-caa-gga-gac-tcg-cta-ct	ctg-gcg-ctt-gtg-ttt-caa-c
ERb	tca-gct-tgt-gac-ctc-tgt-gg	tgt-atg-acc-tgc-tgc-tgg-ac
mPR	tgc-cct-gct-gtg-tga-tct-ta	gat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-at
PGRmC1	agg-tgt-tcg-atg-tga-cca-aag	atc-gta-ctc-atc-ctt-cag-tgc
PR-A	aaa-tca-ttg-cca-ggt-ttt-cg	tac-agc-atc-tgc-cca-ctg-ac
PR-B	gac-tga-gct-gaa-ggc-aaa-gg	cga-aac-tcc-agg-caa-ggt-gt
Примечание. GAPDH – глицеральдегидфосфатдегидрогенеза, mER – мембранный рецептор эстрадиола, mPR, PGRmC1 – мембранные рецепторы прогестерона, PR-A, PR-B – ядерные рецепторы прогестерона. Note. GAPDH – glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, mER – membrane-associated estradiol receptor, mPR, PGRmC1 – membrane-associated progesterone receptors, PR-A, PR-B – nuclear progesterone receptors.

 

Для определения уровней экспрессии генов использовали формулы 0,5^(-∆Ct) – для выявления достоверных различий между группами данных. Результаты представлены в условных единицах (у.е.) = 100¥0,5^(-∆Ct), где ∆Ct = Ct (искомого гена) - Ct(GAPDH).

Все первичные экспериментальные данные обрабатывали с использованием программы GraphPadPrism 5.0. Анализ соответствия признака закону нормального распределения проводили с применением критерия Колмогорова–Смирнова. Сравнение независимых переменных в двух выборках осуществляли непараметрическим методом с применением критерия Манна–Уитни. Критерием значимости при статистических расчетах в данной работе являлось значение показателя вероятности ошибки (p) не более 5%, т.е. p≤0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты анализа эффективности 12-месячной терапии ОС у пациенток с хирургической менопаузой оценивали по суррогатному маркеру – МПКТ (рис. 1). Прирост МПКТ до 3–4% в год расценивали как отсутствие отрицательной динамики, более 4% в год – положительная динамика. Частичный эффект – положительная динамика в одной из трех точек контроля (шейка бедра, трохантер, область Варда).

 

Рис. 1. Влияние варианта терапии на изменение МПКТ у пациенток с хирургической менопаузой.

 

Примечание. МГТ + Са – МГТ + препараты витамина D и кальция (1000 мг); положительная динамика – прирост МПКТ более 4% в первый год терапии, частичный эффект – положительная динамика в одной из трех точек контроля МПКТ (шейка бедра, трохантер, область Варда).

Note. MHT + Ca – vitamin D and calcium (1000 mg) MHT + drugs; positive dynamics is more than 4% increase in BMD for the first year of therapy, a partial effect is positive dynamics in one of the three points for BMD control (the femoral neck, Ward’s area, the trochanteric region).

 

Более выраженный эффект МГТ в сочетании с препаратами кальция и витамина D по сравнению с изолированной МГТ на МПКТ у пациенток с хирургической менопаузой (45% vs 0% пациенток с положительной динамикой МПКТ, p≤0,0001) может быть связан как с более низким исходным уровнем МПКТ (ОС на фоне гиповитаминоза D) у этих пациенток, так и с противовоспалительным и остеопротекторным эффектом витамина D. Из представленных данных видно, что даже адекватно подобранная терапевтическая схема эффективна только в 50% случаев, что совпадает с литературными данными [5–7].

Большое число не отвечающих на терапию пациенток в обеих группах позволило нам провести сравнительный анализ уровня экспрессии молекул-мишеней лекарственной терапии в МНФК до начала лечения (рис. 2).

 

Рис. 2. Уровень мРНК рецепторов стероидных гормонов, витамина D в МНФК и эффективность терапии.

 

Оказалось, что эффективность медикаментозной коррекции (изолированной МГТ и МГТ на фоне витамина D и препаратов кальция) нарушений МПКТ у пациенток с хирургической менопаузой положительно ассоциирована с уровнем экспрессии рецепторов витамина D (VDR) в мононуклеарах периферической крови (до начала лечения). Следовательно, уровень мРНК витамина D может служить потенциальным маркером прогноза эффективности традиционных схем лечения ОС у пациенток с хирургической менопаузой. Уровни экспрессии ядерного рецептора эстрадиола (ER)-b и мембранного рецептора прогестерона (PGRMC1) в МНФК пациенток до начала лечения продемонстрировали тенденцию к повышению у женщин, отвечающих на терапию. Увеличение выборки, вероятно, позволит достигнуть статистической достоверности, однако уже из представленных данных видно, что наибольшей информативной значимостью обладает именно экспрессия витамина D. Ранее были предприняты попытки поиска маркеров прогноза эффективности применения отдельных вариантов терапии остеопороза. В частности, для рекомбинантного паратгормона таким маркером оказалась гиперкальциурия [8]. Гиперкальциурия, которая часто встречается у пациентов с остеопорозом, позволяет предсказать не отвечающих на 6-месячное лечение рекомбинантным паратгормонам, и это помогает оптимизировать лечение конкретного пациента. Для традиционной схемы лечения менопаузального остеопороза (препараты МГТ, витамина D, кальция) таких молекулярных маркеров ранее предложено не было.

Следует отметить, что на фоне терапии обоих режимов МГТ произошла нормализация показателей кальций-фосфорного обмена, уровня паратгормона и витамина D. Таким образом, оба выбранных режима МГТ могут оказывать выраженный блокирующий эффект на костную резорбцию у женщин с хирургической менопаузой. МГТ переносилась пациентами хорошо, и после окончания периода наблюдения все женщины продолжили лечение, т.е. приемлемость терапии составила 100%.

Заключение

Уровень экспрессии VDR в МНФК крови пациенток с хирургической менопаузой и ОС достоверно ниже (р=0,023) в группе женщин с отсутствием/недостаточным эффектом на 12-месячной терапии препаратами МГТ в сочетании с препаратами кальция и витамина D. Так как этот показатель можно оценить до начала лечения МГТ, то его можно рассматривать как маркер прогноза эффективности классической терапии ОС. При отрицательном прогнозе целесообразно рассмотреть другие варианты антирезорбтивной терапии.

About the authors

Yansiiat Z. Zaydieva

Moscow Regional Research Institute of Obstetrics and Gynecology

Author for correspondence.
Email: 7726101@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-4911-719X

D. Sci. (Med.), Prof., Moscow Regional Research Institute of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, Moscow

Elena V. Kruchinina

Moscow Regional Research Institute of Obstetrics and Gynecology

Email: kruchinina.elena@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3628-0863

Cand. Sci. (Med.), Moscow Regional Research Institute of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, Moscow

Olga S. Gorenkova

Moscow Regional Research Institute of Obstetrics and Gynecology

Email: olga-gore@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4448-5877

Cand. Sci. (Med.), Moscow Regional Research Institute of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, Moscow

Elena Yu. Polyakova

Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institute

Email: polyakova_eu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1389-0271

Cand. Sci. (Med.), Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institute

Russian Federation, Moscow

Elena N. Kareva

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: elenakareva@mail.ru

D. Sci. (Med.), Prof., Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow

Daria O. Kurguzova

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: kurguzova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1759-5592

Assistant, Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow

Natalya A. Kochina

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: natalyakochina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7748-0071

Senior Research Officer, Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow

Katherine V. Krasnoshchok

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: katherinekamagina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3538-1977

biochemist, Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow

Svetlana Yu. Serebrova

Scientific Center for Expertise of Medical Products

Email: svetaserebrova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7163-7119

D. Sci. (Med.), Prof., Scientific Center for Expertise of Medical Products

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files