Anti-Mullerian hormone and its predictive value for assessing oocyte quality

Full Text

Введение

Антимюллеров гормон (АМГ, AMH) в настоящее время считается самым ранним и наиболее чувствительным маркером овариального резерва. Преимуществами данного маркера по сравнению с другими маркерами овариального резерва, такими как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и количество антральных фолликулов (КАФ), являются возможность проводить анализ в любой день менструального цикла, практически отсутствие вариабельности результатов у разных исследователей и высокая надежность, несмотря на отсутствие международных стандартов диагностического теста [1]. АМГ впервые обнаружен Альфредом Жостом в 1947 г. как тестикулярный фактор, отличный от тестостерона, который отвечает за регрессию мюллерова протока в ходе развития плода. Изначально считалось, что функция АМГ ограничена лишь внутриутробной половой дифференциацией плода. Исследования конца XX в. показали, что АМГ играет важную роль в постнатальной биологии яичников. О его клинической ценности как прогностического фактора ответа яичников в циклах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) впервые сообщалось в 2002 г. [2]. Точность АМГ в прогнозировании ответа яичников на контролируемую овариальную стимуляцию (КОС) послужило его широчайшему клиническому применению в современной практике для персонализации протоколов стимуляции ВРТ, подбора оптимальной дозы и профилактики риска гиперстимуляции яичников.

Помимо возможности прогнозирования результатов ВРТ АМГ имеет и другие клинически значимые области применения в репродуктивной медицине. Установлено, что АМГ также является прогностическим маркером времени наступления менопаузы [3], а у женщин репродуктивного возраста с низким уровнем АМГ он ассоциирован с риском ранней менопаузы. Кроме того, измерение уровня АМГ также применяется для диагностики синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), при котором уровни АМГ коррелируют со степенью тяжести проявлений СПКЯ и риском синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) [4]. Анализ уровня АМГ у женщин с впервые выявленными онкологическими заболеваниями является ценным инструментом при разработке стратегий сохранения фертильности. Наконец, определение уровня АМГ помогает разработать стратегию сохранения фертильности у женщин перед оперативным вмешательством на органах малого таза, в программах отложенного материнства, при диагностике преждевременной недостаточности яичников и др. Учитывая, что клинические факторы риска при преждевременной недостаточности яичников выявляются лишь у 50% женщин, мониторирование уровня АМГ у женщин репродуктивного возраста может своевременно диагностировать снижение овариального резерва и ориентировать пациенток на реализацию репродуктивной функции или криоконсервацию ооцитов/эмбрионов.

Для прогнозирования ответа яичников на КОС применяется несколько клинических маркеров, включая возраст женщины, уровни ФСГ и эстрадиола, а также КАФ. Так, аналитическая работа A. La Marca и соавт. показала, что АМГ в целом является лучшим прогностическим маркером ответа яичников на КОС, чем возраст, уровни ФСГ, эстрадиол и ингибин B [5]. Последующие проспективные многоцентровые исследования продемонстрировали также преимущество АМГ по сравнению с КАФ в прогнозировании ответа яичников на стимуляцию. Зависимое от возраста снижение успешности ВРТ в основном обусловлено снижением не только количества, но и качества ооцитов. И если в случае количественной оценки овариального резерва мы ориентируемся на ряд параметров (возраст женщины, уровень АМГ, ФСГ, эстрадиола, КАФ), то оценка качества полученных ооцитов проводится лишь по субъективным параметрам – на основании установленных морфологических критериев. В идеале же оценка качества ооцитов должна проводиться на основании объективных маркеров, поэтому в последнее время все большее количество исследований посвящается изучению взаимосвязи различных маркеров и качества ооцитов, в том числе и АМГ.

Цель обзора – обобщение современных данных по клинической ценности АМГ в прогнозировании не только количественных, но и качественных результатов ВРТ.

АМГ и физиология яичников

АМГ представляет собой гликопротеин, принадлежащий к суперсемейству трансформирующих факторов роста b, который продуцируется у женщин исключительно гранулезными клетками мелких и крупных преантральных и мелких антральных фолликулов яичников. Это суперсемейство включает активины, ингибины, костные морфогенетические белки, а также факторы роста и дифференциации. АМГ влияет на экспрессию более 700 генов и действует опосредовано через рецепторы АМГ 2-го типа, BMPR 1a (Alk3), BMPR 1b (Alk6) или ACVR 1 (Alk2). Этот маркер участвует в регуляции активации и роста фолликулов и скорости возобновления мейоза ооцитов.

Яичники плода женского пола начинают продуцировать АМГ примерно на 36-й неделе внутриутробного развития, затем уровень повышается на протяжении пубертатного периода, достигая пика в возрасте 25 лет, после чего начинает постепенно снижаться практически до недиагностируемых уровней в период менопаузы [6].

Как известно, у человека пол формируется непосредственно в момент оплодотворения, а вот эмбриональная половая дифференциация начинается на 6-й неделе гестации. У эмбриона мужского пола клетки Сертоли яичек секретируют АМГ и андрогены, под воздействием последних из вольфовых протоков формируется половая система по мужскому типу. АМГ вызывает необратимую регрессию мюллерова протока, которая завершается к концу 9-й недели гестации. В отсутствие АМГ мюллеровы протоки дифференцируются в матку, фаллопиевы трубы и верхнюю часть влагалища. У эмбрионов женского пола дефицит АМГ позволяет мюллерову протоку развиваться дальше, в то время как недостаток андрогенов вызывает регрессию вольфовых протоков, что приводит к формированию внутренних органов половой системы по женскому типу.

АМГ также регулирует процессы фолликулогенеза за счет сдерживания рекрута примордиальных и преантральных фолликулов. Это происходит опосредованно за счет снижения экспрессии фактора роста фибробластов, фактора роста кератиноцитов, фактора стволовых клеток в фолликулах. Когда преантральные фолликулы превращаются в более крупные антральные фолликулы, продукция АМГ снижается, фолликулы становятся более чувствительными к ФСГ, и формируется доминантный фолликул. A. Durlinger и соавт. [7] продемонстрировали, что у мышей с дефицитом АМГ отмечается усиление рекрутирования примордиальных фолликулов c одновременным усилением атрезии и ранним истощением овариального резерва фолликулов. Так как АМГ экспрессируется на фолликулах, у которых отсутствуют рецепторы к ФСГ, то его уровень относительно независим от уровня гонадотропинов, что позволяет определять уровень АМГ в любой день менструального цикла. Некоторые исследования показывают, что значения АМГ могут незначительно колебаться на протяжении менструального цикла, при этом наибольшие отклонения отмечаются у молодых женщин с более высоким базальным АМГ по сравнению с женщинами старшего репродуктивного возраста, у которых выявляются более низкие базальные уровни АМГ [8]. Возможны также незначительные колебания уровня АМГ при измерении этого параметра в различные менструальные циклы.

На уровень АМГ оказывает влияние целый ряд факторов. Так, например, при СПКЯ диагностируются повышенные уровни AMГ [9], причина данного факта до конца не изучена. Повышенное содержание этого параметра в сыворотке может быть следствием воздействия ряда факторов, играющих ведущую роль в патогенезе СПКЯ, например гиперандрогенемии. Помимо гиперандрогенемии, гиперинсулинемия может выступить фактором повышенного синтеза АМГ. Принимая во внимание тот факт, что при СПКЯ происходит усиленная секреция андрогенов клетками гранулезы и теки под воздействием инсулина [10], нельзя исключить опосредованное влияние инсулина на синтез АМГ. Прием комбинированных оральных контрацептивов или введение агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона могут снижать уровень АМГ, который обычно возвращается к исходным значениям через 3–4 мес после отмены препаратов. К факторам, снижающим уровень АМГ, относят эндометриоз, операции на органах малого таза (яичниках), генетические факторы (как премутация FMR1 и мутация BRCA1) [11–13]. Кроме того, на уровень АМГ могут оказывать влияние факторы окружающей среды и образ жизни пациентки. Так у курящих женщин отмечено более раннее начало менопаузы и более быстрое снижение уровня АМГ, предположительно, за счет истощения антральных фолликулов [14]. Отмечена также прямая зависимость между концентрацией АМГ в сыворотке и уровнем 25-гидроксивитамина D [15], что позволяет предположить участие витамина D в регуляции овариального резерва.

Прогнозирование количественных результатов ВРТ

В 2002 г. D. Seifer и соавт. впервые сообщили о взаимосвязи между уровнем циркулирующего АМГ и ответом яичников на лечение гонадотропином. Они обнаружили, что более высокий уровень АМГ в сыворотке в 3-й день стимуляции коррелировал с бóльшим количеством полученных ооцитов. В частности, у женщин с хорошим ответом на КОС (получено ≥11 ооцитов) средние концентрации АМГ в сыворотке в 2,5 раза выше таковых, чем у женщин, у которых получено ≤6 ооцитов [16]. Позднее многочисленные исследования подтвердили, что уровни АМГ в сыворотке сильно коррелируют с количественными результатами ВРТ [17].

На протяжении последнего десятилетия увеличивается доля пациенток в программах ВРТ с бедным ответом яичников на КОС [18], который может быть обусловлен как снижением овариального резерва, так и недостаточным ответом яичников на стимуляцию при сохранном овариальном резерве. В любом случае, у пациенток отмечается более низкая частота наступления беременности после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) по сравнению с женщинами того же возраста с нормальным ответом. Возможность точно просчитать слабый ответ на КОС критически важна, так как она помогает врачам надлежащим образом прогнозировать сниженную вероятность наступления беременности, а также оптимизировать протоколы для слабого ответа с целью улучшения результатов. Метаанализ 28 исследований с участием женщин, проходивших программу ЭКО, показал, что уровень АМГ является более точным прогностическим маркером бедного ответа на овариальную стимуляцию по сравнению с возрастом женщины [19]. Сочетание двух показателей (АМГ и возраст) не дало повышения точности прогноза. Дальнейшее углубленное изучение прогностической значимости АМГ с участием более 700 пациенток показало, что этот маркер более достоверен в прогнозировании слабого ответа яичников на стимуляцию по сравнению с КАФ и ингибином В (p<0,001) [20].

Особый интерес у репродуктологов вызывает возможность прогнозирования результатов КОС у женщин со сниженным овариальным резервом. Систематический обзор, проведенный A. La Marca и соавт., показал, что низкие пороговые значения АМГ (0,1–1,66 нг/мл) демонстрируют чувствительность, равную 76%, и специфичность – 79% [21]. Недостаточно высокий уровень специфичности может приводить к ложным прогнозам на КОС, поэтому уровень АМГ не должен использоваться как повод для отказа женщине в лечении.

Избыточный ответ яичников на стимуляцию гонадотропинами возникает примерно в 7% циклов ЭКО, а у женщин моложе 30 лет риск гиперстимуляции возрастает до 15% [22]. Установлено, что факторами риска развития СГЯ являются низкий индекс массы тела, молодой возраст и СПКЯ, но наиболее прогностически ценным фактором является наличие 15 и более фолликулов диаметром более 10 мм в день введения триггера хорионического гонадотропина человека [23]. Применение маркеров овариального резерва, таких как АМГ, для прогнозирования гиперстимуляции яичников может помочь репродуктологу в выборе соответствующего протокола КОС и при необходимости скорректировать дозу гонадотропина, а также своевременно проводить профилактические мероприятия СГЯ, такие как замена триггера, сегментация цикла и т.д.

В систематическом обзоре четырех исследований, в которых на основании уровня АМГ проводилось прогнозирование чрезмерного ответа на стимуляцию гонадотропинами, установлено, что высокие пороговые значения АМГ (3,36–5,0 нг/мл) обладают достаточной чувствительностью и специфичностью (53–90,5 и 70–94,9% соответственно) для прогнозирования СГЯ [24]. Метаанализ данных более 1 тыс. женщин, проведенный S. Broer и соавт., показал, что АМГ является надежным прогностическим маркером избыточного ответа яичников на стимуляцию даже в случаях назначения низких доз гонадотропинов [25]. Полученные результаты свидетельствуют о надежности АМГ в качестве прогностического маркера КОС на введение гонадотропинов и подбора персонализированных протоколов овариальной стимуляции.

Особый интерес, на наш взгляд, представляют исследования, в которых анализируется взаимосвязь между уровнем АМГ и качеством ооцитов, эмбрионов и последующая частота имплантации, что позволяет позиционировать АМГ как маркер качества ооцитов.

Качество ооцитов и эмбрионов

Целый ряд исследований посвящен изучению взаимосвязи уровня АМГ с качеством ооцитов, качеством эмбрионов и/или частотой имплантации [26, 27]. В одном из первых исследований, изучавших потенциальную связь между АМГ и качеством ооцитов в циклах ЭКО/интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), T. Ebner и соавт. обнаружили, что высокие и низкие уровни АМГ ассоциированы со сниженным качеством ооцитов. В группе пациенток с нормальным уровнем АМГ регистрировалось 50% ооцитов высокого качества, тогда как в группах пациенток c высоким и низким уровнем АМГ – лишь 30%.

При морфологическом исследовании ооцитов в группе пациенток с низким уровнем АМГ обнаруживалась темная центральная грануляция в цитоплазме, тогда как у пациенток с высоким уровнем АМГ отмечена агрегация гладкого эндоплазматического ретикулума. В том же исследовании обнаружили, что уровни АМГ не коррелировали с частотой оплодотворения или качеством эмбрионов, оцениваемых на стадии дробления или бластоцисты [28]. Взаимосвязь между уровнем АМГ с качеством ооцитов, частотой оплодотворения ооцитов и последующей имплантацией эмбрионов подтверждена в работе E. Borges и соавт. Уровень АМГ в сыворотке ассоциирован такими морфологическими характеристиками ооцитов, как присутствие агрегатов гладкого эндоплазматического ретикулума, крупного перивителлинового пространства, гранулярности перивителлинового пространства и др. [29].

Интересно, что в двух недавних исследованиях продемонстрирована взаимосвязь между уровнем АМГ и плоидностью эмбриона. Так A. La Marca и соавт. [30] сообщали о сильной взаимосвязи, которая не зависела от возраста пациентки, между уровнем АМГ и частотой формирования эуплоидных бластоцист в программах ЭКО/ИКСИ. Увеличение уровня АМГ на 1 нг/мл повышало на 27% вероятность получения эуплоидной бластоцисты для последующего переноса в полость матки. В своем исследовании X. Jiang и соавт. [31] выявили закономерность, что сниженный уровень АМГ (<1,50 нг/мл) ассоциируется с повышенным риском анеуплоидии эмбрионов лишь у женщин старшего репродуктивного возраста (>35 лет), у более молодых женщин такой закономерности не выявлено. Возможно, данный факт связан с большей вероятностью получения анеуплоидных эмбрионов у женщин старше 35 лет. Полученные данные свидетельствуют о том, что низкий уровень АМГ может быть прогностическим фактором риска анеуплоидии эмбрионов. Возможно, что низкие уровни АМГ отражают не только сокращение фолликулярного резерва, но также снижение продукции АМГ отдельными фолликулами, что может указывать на низкое качество ооцитов. Так, исследовательской группой под руководством R. Fanchin и соавт. при изучении взаимосвязи между способностью гранулезных клеток продуцировать АМГ и имплантационным потенциалом последующего эмбриона установлено наличие выраженной корреляции между фолликулярным уровнем АМГ и имплантацией эмбрионов [32]. Более того, несмотря на то, что АМГ секретируется в основном гранулезными клетками преантральных и мелких антральных фолликулов, экспрессия АМГ отмечается в кумулюсных клетках, окружающих преовуляторный ооцит. Кумулюсные клетки, как известно, также информативны в отношении оценки качества ооцита, так как их профиль экспрессии генов, уровень апоптоза и длина теломер ассоциированы с качеством последующих эмбрионов и их имплантационным потенциалом. Кроме того, нужно отметить, что установлена также взаимосвязь между базальными уровнями АМГ и целостностью и жизнеспособностью ДНК кумулюсных клеток, что также свидетельствует о возможности маркера прогнозировать качество ооцитов.

Так как АМГ синтезируется ооцитами, потенциально способными к оплодотворению, то интересны также работы, анализирующие его уровень с частотой оплодотворения ооцитов и последующей имплантацией эмбрионов. Так, в своей работе K. Majumder и соавт. [33] обнаружили выраженную корреляцию между уровнем АМГ и количеством оплодотворенных ооцитов. Ретроспективный анализ E. De Conto и соавт. [34] показал прямую зависимость между уровнем АМГ и частотой формирования бластоцист (p<0,002), не зависящей от возраста пациенток. Аналогичные результаты получены в последующем ретроспективном исследовании, где у пациенток как моложе, так и старше 35 лет высокий уровень АМГ коррелировал с высокой частотой формирования бластоцист [35]. Дальнейшее изучение тематики продолжилось по оценке взаимосвязи между уровнем АМГ и вынашиванием беременности. Так, B. Lyttle Schumacher и соавт. провели проспективное когортное исследование с участием более 500 женщин, у которых перед наступлением самопроизвольной беременности измеряли уровень АМГ. После поправки на возраст матери, индекс массы тела, расовую принадлежность, наличие выкидышей в анамнезе установлено, что у женщин с АМГ=0,4 нг/мл и менее риск невынашивания беременности повышается в 2,3 раза по сравнению с пациентками с уровнем АМГ=1,0 нг/мл и выше [36]. Полученные результаты согласуются с недавним проспективным когортным исследованием, которое показало наличие обратно пропорциональной взаимосвязи между риском невынашивания беременности и уровнем АМГ. Эта взаимосвязь подтверждена как в группе пациенток до 35 лет, так и старшего репродуктивного возраста (старше 35 лет) [37]. B. Tarasconi и соавт. [38] провели аналогичное исследование, но с участием большего числа пациенток (n=1060), и также установили обратно пропорциональную взаимосвязь между уровнем АМГ и частотой невынашивания беременности, которая также не зависела от возраста женщины. Напротив, чрезмерно высокие уровни АМГ ассоциированы с повышенным риском выкидыша, что показано в работе N. Gleicher и соавт. [39]. В целом нужно отметить, что уровень AMГ обратно пропорционален риску невынашивания беременности, что свидетельствует о том, что АМГ отражает также качество ооцитов и последующих эмбрионов.

Очевидно, что представленные данные не являются достаточными, и необходимо проводить дальнейшие исследования по изучению роли АМГ в оценке качества ооцитов и эмбрионов.

Диагностические тест-системы для определения уровня АМГ

За последние 20 лет произошла значительная эволюция методов лабораторного определения АМГ. В широкую клиническую практику определение уровня АМГ вошло в 1999 г., когда разработали первые диагностические тест-системы массового использования – Immunotech (IOT) и Diagnostic Systems Lab (DSL). Поток исследований АМГ был практически поровну поделен между этими двумя методами, что представляло некоторую сложность в интерпретации результатов, так как в тест-системах использовались разные антитела и стандарты прослеживаемости, соответственно, разница между получаемыми результатами была значительная. После того, как компании Immunotech и Diagnostic Systems Lab вошли в состав международной компании Beckman Coulter Inc., данная проблема решилась путем разработки новой микропланшетной тест-системы для иммуноферментного анализа (ИФА) – AMH Gen II, объединившей два метода определения АМГ в один, с сохранением наиболее перспективных характеристик каждой. Таким образом, на рынке появился единый метод тестирования АМГ, где использованы антитела DSL и стандарт IOT, что позволило добиться единообразия результатов [40]. Далее на смену тест-системе AMH Gen II, выполняемой в режиме «ручного» ИФА, ожидаемо пришел полностью автоматический иммунохемилюминесцентный анализ, также разработанный Beckman Coulter Inc. – Access AMH. Использование тех же антител позволило говорить о взаимозаменяемости результатов при повышении аналитических характеристик тестирования, таких как повышение чувствительности теста в 16 раз, ускоренное получение результатов (в 4 раза быстрее при автоматизации процесса) и сокращение трудозатрат до 80%. На сегодняшний день на рынке существует несколько диагностических тестов для определения АМГ, ключевыми из которых являются Access AMH (Beckman Coulter Inc.) и Roche AMН Plus (Roche Diagnostics International Ltd), причем последний также использует адаптированные антитела метода AMH Gen II (Beckman Coulter Inc.) и прослеживается к его внутреннему стандарту. Это важно в том числе для эффективного продолжения процесса международной стандартизации метода определения АМГ [41]. Совсем недавно одна из таких автоматизированных платформ получила разрешение Управления по контролю пищевых продуктов и лекарств в США для определения резерва яичников (http://www.fdanews.com/articles/179932-fda-grants-cle-to-roches-anti-mullerian-hormone-test-elecsys). В то же время возникает вопрос о взаимозаменяемости результатов, полученных на разных диагностических платформах. Результаты исследования A. La Marca и соавт. (2020 г.) показали, что данные, полученные методом Access AMH и Elecsys AMH для определения стартовой дозы фоллитропина дельта, в программах КОС в целом сопоставимы (разница составляет лишь 12%) [41].

Заключение

В последние 15 лет AMГ завоевал лидерство в качестве наиболее информативного биохимического маркера, отражающего состояние яичников. Он считается самым ранним и наиболее чувствительным маркером репродуктивного старения, коррелируя с пулом первичных фолликулов, помогает определить стартовую дозу гонадотропинов при КОС. Точность AMГ в прогнозировании реакции яичников на стимуляцию, возможно, привела к его наиболее широкому использованию в клинике на сегодняшний день: индивидуализация подбора протоколов стимуляции и профилактика рисков гиперстимуляции яичников, консультирование по планированию беременности и сохранению фертильности.

Несмотря на подтвержденную способность АМГ предоставлять количественную информацию о состоянии яичников, в настоящее время лишь накапливаются знания о его возможности отражать качество ооцитов. Углубленное изучение патофизиологии AMГ, возможно, приведет к разработке новых фармакологических подходов к лечению с использованием агонистов и/или антагонистов AMГ для решения широкого спектра проблем в области репродукции. Необходимо также проводить дальнейшее изучение роли АМГ при различных гинекологических заболеваниях, затрагивающих гормональную функцию яичников.

About the authors

Natalia V. Aleksandrova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Author for correspondence.
Email: alexandrova.ncagip@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7353-9515

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, 4, akademika Oparina street, Moscow, 117997

References

Supplementary files