The value of azoximer bromide for optimization of therapy for HPV-associated cervical precancerous diseases

Full Text

Введение

За последние 15 лет наблюдается значительный рост вирус папилломы человека (ВПЧ)-ассоциированных онкозаболеваний, составляющих более 12% от всех злокачественных новообразований в мире [1, 2]. Наиболее частая локализация отмечается в шейке матки с поражением в молодом репродуктивном возрасте, что негативно влияет на демографические показатели [3]. Распространенность предраковых заболеваний шейки матки (SIL) также значительно растет, составляя 10,7–38,8% от всех гинекологических заболеваний у женщин репродуктивного возраста [4]. Масштабы бремени ВПЧ-ассоциированных SIL привели к разработке комплекса лечебных и профилактических мероприятий, отраженных в программах Всемирной организации здравоохранения и клинических рекомендациях Российского общества акушеров-гинекологов лечения пациенток с SIL [5]. Однако на сегодняшний день существующие комплексные методы оперативного лечения цервикальных интраэпителиальных неоплазий высокой степени онкогенного риска (HSIL) сопровождаются рецидивированием процесса в 48–62,4%, с персистенцией ВПЧ в 58% случаев [6, 7], что диктует необходимость поиска новых методов комплексной терапии. Согласно мировым исследованиям при активации папилломавирусной инфекции (ПВИ) с развитием неопластических изменений цервикального эпителия выявлены различные иммунные дисфункции [8]. Общеизвестно, что влияние онкопротеина Е6, продуцируемого ПВИ, приводит к развитию иммунологической толерантности на локальном уровне, что проявляется подавлением апоптоза вирусинфицированных клеток, снижением и блокадой выработки интерферонов, торможением миграции клеток Лангерганса [9]. В то же время имеются данные о генетически детерминированных значительных изменениях цитокинового профиля цервиковагинального содержимого при развитии ВПЧ-ассоциированных неоплазий, свидетельствующие о развитии различных иммунопатологических реакций на местном уровне при воздействии ВПЧ, имеющих параллели с дальнейшим прогнозом развития заболевания [10]. Полученные результаты привели к необходимости коррекции выявленных иммунных дисфункций на консервативном этапе лечения [11]. В отечественные и зарубежные клинические протоколы внесено применение иммуномодулирующего противовирусного препарата инозин пранобекс [12]. Однако достичь желаемого результата элиминации ВПЧ удалось лишь в 75–78% случаев, поскольку у ряда пациенток имеется полиморфизм генов, кодирующих выработку про- и противовоспалительных цитокинов, который способствует сохранению ВПЧ в криптах эндоцервикса с последующим рецидивированием неоплазии [13]. Выявление полиморфных генов, контролирующих экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов, объясняет разнообразие индивидуального реагирования врожденного и приобретенного иммунитета [14]. Поэтому бессимптомное или, напротив, чрезмерно бурное течение инфекций репродуктивного тракта, способствующих неопластической трансформации цервикального эпителия, у части женщин может быть объяснено индивидуальными иммуногенетическими особенностями [15]. Полученные результаты создали предпосылки для изучения иммунного микроокружения неопластически пораженного экзо- и эндоцервикса с дальнейшей разработкой локальной иммуномодулирующей фармакотерапии для улучшения исходов лечения HSIL. Выбор исследуемого препарата основывался на характеристиках иммуномодуляторов. Наиболее оптимальным для исследования оказался азоксимера бромид – сополимер N-окси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбокси)-1,4-этиленпиперазиния бромида, поскольку у данного препарата иммуномодуляция обусловлена непосредственным воздействием на фагоцитирующие клетки и естественные киллеры со стимуляцией антителообразования, что позволяет восстановить локальный иммунитет при неоплазии у иммунокомпрометированных пациенток. При этом антиоксидантное и мембраностабилизирующее действие азоксимера бромида для коррекции локальной тканевой гипоксии неоплазированного эндоцервикса может тормозить эпигенетические мутации в пораженных вирусом клетках.

Цель исследования – изучить клиническую эффективность локальной иммунокоррекции азоксимера бромидом в комплексной терапии цервикальных интраэпителиальных неоплазий.

Материалы и методы

Провели обследование и лечение 40 пациенток с HSIL. Диагноз поставлен по результатам патоморфологического исследования цервикобиоптатов по результатам скрининга в соответствии с критериями включения и исключения (основная группа). Критерии включения в исследование: пациентки с ВПЧ-ассоциированными HSIL, репродуктивный возраст (женщины 18–45 лет), письменное информированное согласие пациенток на участие в исследовании. Критерии исключения из исследования: возраст женщин младше 18 и старше 45 лет, беременность и послеродовый период 1 год, наличие тяжелой соматической патологии, злокачественные опухоли любой локализации, положительный тест на ВИЧ-инфекции, сифилис, гепатит В и С, индекс Кетле ≥30. Группу сравнения составили 30 пациенток с ВПЧ-ассоциированными цервикальными интраэпителиальными неоплазиями низкой степени онкогенного риска (LSIL). Исследование проводили на базе Медицинского центра «Ангиолайн плюс» (г. Екатеринбург). Обследование включало в себя сбор анамнеза, течение заболевания, общеклиническое исследование, исследование микрофлоры половых путей женщин, цитологическое исследование методом жидкостной цитологии и генотипирование ВПЧ с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени с выявлением, дифференциацией и количественным определением ДНК ВПЧ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59-го типа в клиническом материале (образцах из эпителия шейки матки) методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентной детекцией. Результаты концентрации ДНК ВПЧ выражались в у.е. Hybrid Capture. Иммуногистохимическое исследование цервикобиоптатов проводили по стандартной методике с окраской растворами антител фирмы Bond RTU Primary (США), специфичных к одному из исследуемых маркеров (CD3, CD56, СD20, CD138, M-CSF). Проявление реакции осуществляли системой визуализации Dako Cytomation (Dako, Великобритания). Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (BioGenex, США). Оценка полученных результатов осуществлялась по степени флюоресценции и количеству образованных комплексов «антиген–антитело» в процентном эквиваленте. Подсчет количества позитивных клеток выполняли при увеличении ×400 не менее чем в 10 полях зрения. Группу контроля для выполнения данного этапа исследования составили 30 пациенток, прооперированных по поводу гинекологической патологии в ФГБУ НИИ ОММ (г. Екатеринбург), без видимых изменений на шейке матки, с «нормальной» цитограммой и отрицательным тестом на ДНК ВПЧ, отсутствием онкологических процессов органов репродуктивной системы.

В дальнейшем для проведения иммуномодуляции перед оперативным лечением пациентки разделены на 2 группы. Распределение пациенток по группам проводили рандомизированно – методом конвертов. Группы стратифицированы между собой по всем признакам, характеризующим показатели заболевания. В 1-ю группу вошли 20 пациенток, которым после установления диагноза HSIL на этапе подготовки к оперативному лечению назначена включенная в Протокол лечения SIL системная иммуномодулирующая терапия препаратом инозин пранобекс по 2 таблетки 3 раза в день №10; 2-ю группу составили 20 пациенток, которым после установления диагноза HSIL назначена комплексная иммуномодуляция с включением на дооперационном этапе наряду с системной терапией инозин пранобексом местного иммуномодулирующего препарата азоксимера бромида по 1 свече 1 раз в день №10 с последующим изучением клинической эффективности проведенного лечения. Длительность исследования составила 12 мес. Оценка клинической эффективности проводилась на основании клинической симптоматики – мониторинга рецидивирования неоплазии через 1, 3, 6 мес и 1 год по данным лабораторных (цитологическое, молекулярно-биологическое) и инструментальных (кольпоскопия) исследований.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью Microsoft Excel 2010 и стандартных пакетов программ (SPSS 23.0, Statistica for Windows 10). Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, представлены в виде следующих параметров: среднее арифметическое, стандартные и среднеквадратические отклонения, ошибка средней арифметической (ошибка репрезентативности, 95% доверительные интервалы). Анализ статистической значимости различий качественных признаков, а также количественных признаков, не соответствующих закону нормального распределения, проведен с помощью критерия ÷² Пирсона с поправкой Йейтса. Статистически значимыми принимались различия при р≤0,05. Для изучаемых факторов проводился расчет показателей относительного риска (ОР) по Мантелю–Хенцелю (Mantel–Haensel) согласно способу, принятому при эпидемиологических исследованиях по методу «случай–контроль». Вычислялся как отношение инцидента заболевания в группе, подвергшейся воздействию изучаемого фактора I_e, к соответствующему инциденту в группе, не подвергшейся данному воздействию I_o.

ОР=I_e/I_o =[a/(a+b)]/[c/(c+d)].

Результаты и обсуждение

Обследованные пациентки в группах сопоставимы по возрасту, паритету, становлению менструальной функции. Средний возраст всех обследованных составил 32,6±2,5 года. Результаты генотипирования ВПЧ у обследованных пациенток основной группы продемонстрировали доминирование 16 и 33 генотипов у каждой 3-й женщины, со значительно более часто встречающимся 16-м типом у пациенток с HSIL в сравнении с данным показателем у пациенток с группой сравнения (p=0,001), что совпадает с результатами ряда исследователей [16]. Анализ других онкогенных генотипов ВПЧ продемонстрировал более частое выявление 18-го типа у пациенток основной группы при сравнении с группой сравнения (20 и 7,5% соответственно; ÷²=45,6 при р=0,001) и 45-го типа, выявленного в 5 и 25% соответственно (÷²=39,9 при р=0,001), что свидетельствует о предикторной роли и высоком риске развития HSIL при обнаружении данных типов ВПЧ (ОР=7,17 при р=0,001), является прогностически неблагоприятным, что не согласуется с результатами некоторых исследователей [17] и характеризует региональные особенности.

При анализе результатов бактериоскопического исследования и лейкоцитарной реакции вагинального содержимого выявили, что имеется доминирование 3-й степени чистоты у пациенток с HSIL и 4-й – у пациенток с LSIL, что может свидетельствовать об иммунодефицитном состоянии у пациенток с HSIL, в то время как при LSIL на фоне ВПЧ происходит активация макрофагально-фагоцитарного звена в ответ на внедрение вируса, что сопровождается лейкоцитарной реакцией и совпадает с результатами исследователей [18].

Полученные данные иммуногистохимического анализа у обследованных пациенток с HSIL установили статистически значимое увеличение доли клеток с экспрессией рецепторов CD56 по сравнению с аналогичным показателем группы сравнения, что свидетельствовало о значительной активации клеточного иммунитета. Изучение В-клеточного звена адаптивного иммунитета (CD20, CD138) продемонстрировало значительную его активацию (в клетках стромы) в сравнении с показателем группы контроля (÷²=62,7 при р=0,017), что может свидетельствовать о гипериммунном ответе при HSIL. Оценка Т-клеточного звена иммунитета по количеству клеток, экспрессирующих CD3, как основного маркера Т-лимфоцитов, также продемонстрировала его значительное превышение при HSIL. Поскольку активная миграция нейтрофилов в патологический очаг вызывает чрезмерное деструктивное воздействие на окружающие клетки и ткани с дальнейшим усугублением патологического процесса, своевременная его инактивация необходима для оптимизации адаптивного иммунного ответа. Анализ инфильтрации тканей цервикального эпителия M-CSF достоверно продемонстрировал наименьшую их активность у пациенток с HSIL и наибольшую с LSIL по сравнению с группой контроля (÷²=72,6 при р=0,017 для HSIL). В зависимости от длительности данного патологического процесса при первично выявленном процессе наблюдался низкий уровень экспрессии M-CSF в клетках эпителия и стромы. Выявленные изменения данного показателя в сторону снижения активности при HSIL в клетках эпителия и стромы характеризовали снижение работы клеточного звена адаптивного иммунитета, что может свидетельствовать об иммунодефицитном состоянии и являться маркером неблагоприятного исхода. Таким образом, ВПЧ-ассоциированные цервикальные интраэпителиальные неоплазии сопровождаются изменениями локального иммунного микроокружения в эпителии и строме неопластически измененных тканей, выраженность данных изменений сопряжена с тяжестью патологического процесса, что диктует необходимость коррекции таких изменений на местном уровне.

При динамическом наблюдении у пациенток 2-й группы, получавших комплексную иммуномодулирующую терапию азоксимера бромидом, зарегистрировано лишь 3 (15%) случая рецидива неопластического процесса через 6 и 12 мес на послеоперационном этапе. У пациенток 1-й группы при проведении цитологического исследования через 6 мес после лечения регистрировались случаи рецидива цервикального неопластического процесса в виде низкой степени онкогенного риска в 30% случаев, а признаки воспалительного процесса шейки матки – практически у каждой 3-й пациентки, что являлось статистически значимым относительно показателей 2-й группы. При этом необходимо заметить, что сочетание SIL с цервицитом отмечалось в 25% случаев.

Кольпоскопическое исследование продемонстрировало нормализацию кольпоскопической картины в 100% случаев через 3 мес после лечения. Однако через 1 год в когорте больных 1-й группы у 7 (35%) пациенток появились участки с признаками атипии 1-й степени тяжести в виде нежного ацетобелого эпителия, нежной пунктации и мозаики, а также нерезко выраженной йоднегативной зоны, что являлось статистически значимым относительно пациенток, получавших комплексную терапию с применением азоксимера бромида (р=0,001). У женщин 2-й группы наблюдалась нормализация кольпоскопической картины, без проявлений атипии 1 и 2-й степени, а также иных неспецифических признаков, в 95% случаев через 3 и 12 мес, с формированием зоны трансформации 2-го типа.

По результатам молекулярно-биологического исследования элиминация вируса диагностирована через 6 мес более чем у 1/2 пациенток. Однако у женщин из 2-й группы ПВИ зафиксирована лишь в 2 (10%) случаях через 6 мес, без изменения полученных результатов через 1 год. При этом необходимо отметить, что у одной пациентки выявлен уже другой генотип ВПЧ в клинически малозначимом титре, что может свидетельствовать о новом заражении. В 1-й группе ВПЧ продолжал обнаруживаться у 7 (35%) пациенток, также демонстрируя идентичные показатели через 6 и 12 мес, что имело достоверные различия от аналогичного показателя когорты больных из 2-й группы. Таким образом, эффективность терапии продемонстрировала отсутствие ВПЧ у пациенток, получавших дополнительно терапию азоксимера бромидом в 95% случаев, в то время как при традиционной терапии процент элиминации составил 65% (р=0,001).

Анализ уровня вирусной нагрузки продемонстрировал, что ее показатель составил в среднем через 6 мес 0,12±0,16 у.е. Hybrid Capture для 1-й группы и 0,011±0,05 – для 2-й. Через 1 год статистически значимые изменения в данных не зафиксированы и составили 0,11±0,16 для пациенток с традиционной терапией и 0,01±0,04 при применении в составе комплексной терапии азоксимера бромида, что показывает значительно более высокие показатели в когорте больных без применения препаратов для коррекции локального микроокружения.

Побочных явлений при применении азоксимера бромида не выявили.

Заключение

1. В цервикобиоптатах пациенток с HSIL наблюдается повышение доли клеток с экспрессией рецепторов CD20, CD3, CD138 (в клетках стромы) и снижение инфильтрации эпителия M-CSF, что свидетельствует о значительных изменениях иммунного гомеостаза в клетках пораженного эпителия. На основании полученных результатов на этапе подготовки к оперативному лечению пациенток с HSIL целесообразно включение локальной иммунокоррекции для улучшения исходов терапии.
2. Включение в комплексную терапию локального иммуномодулятора азоксимера бромида способствовало снижению рецидивирования процесса в 2 раза, элиминации ВПЧ – в 3,5 раза, что диктует необходимость проведения комплексной иммуномодуляции при лечении HSIL на этапе подготовки к операции.

About the authors

Irina N. Kononova

Pirogov Russian National Research Medical University

Author for correspondence.
Email: irkonmed@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3483-9464

D. Sci (Med.)

Russian Federation, 1, Ostrovityanova street, Moscow, 117997

Yuliya E. Dobrokhotova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: pr.dobrohotova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2786-6181

D. Sci (Med.), Prof.

Russian Federation, 1, Ostrovityanova street, Moscow, 117997

Nadezhda A. Shmakova

Urals Scientific Research Institute for Maternal and Child Care

Email: naschmakova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4797-3876

Graduate Student

Russian Federation, 1, Repina street, Ekaterinburg, 620028

Elena N. Kareva

Pirogov Russian National Research Medical University; Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: elenakareva@mail.ru

D. Sci (Med.)

Russian Federation, 1, Ostrovityanova street, Moscow, 117997; 8-2, Trubetskaya street, Moscow, 119992

Guzel N. Chistyakova

Urals Scientific Research Institute for Maternal and Child Care

Email: 7@niiomm.ru
ORCID iD: 0000-0002-0852-6766

D. Sci (Med.), Prof.

Russian Federation, 1, Repina street, Ekaterinburg, 620028

References

Supplementary files