Effect of inosine pranobex on p16, Ki-67 expression in patients with HPV-associated cervical intraepithelial neoplasia

Full Text

В рамках вторичной профилактики рака шейки матки существенную роль играют совершенствование методов диагностики папилломавирусной инфекции (ПВИ), правильная клиническая интерпретация результатов обследования и своевременное адекватное лечение пациенток с цервикальным предраком. Активная разработка профилактических стратегий, основанная на вирус папилломы человека (ВПЧ)-детекции, углубленное изучение ВПЧ-генотипирования, маркеров пролиферации, метилирования при цервикальной ВПЧ-инфекции, их внедрение в практику побуждают к анализу клинических данных [1-4]. Среди прогностических маркеров риска большое внимание уделяется р16ink4a (или р16) и Ki-67 [5-7]. Признается, что р16/Ki67 - надежный инструмент стратификации риска ВПЧ-позитивных женщин. В пользу информативности р16 и Ki-67 свидетельствуют следующие факты. При обследовании на р16 (без Ki-67) женщин 35-60 лет риск цервикальной интраэпителиальной неоплазии (cervical intraepithelial neoplasia - CIN) 3+ в течение 3 лет был 4,7% среди ВПЧ+/р16-позитивных в сравнении с 0,8% ВПЧ+/р16-негативных женщин в рамках исследования NTCC [6]. Кроме того, 83,7% женщин с последующим развитием CIN 3+ были исходно р16-позитивными. Гиперэкспрессию р16 называют маркером CIN 2 и связывают с высоким риском CIN 3+ в течение 3 лет у ВПЧ-позитивных женщин, особенно в возрасте 35-60 лет. Диагностическое значение в последние годы имеет не только изолированное определение р16 или Ki-67, но одновременное обнаружение р16, Ki-67 (коэкспрессия), что проявляется двойным окрашиванием (dual stain): коричневой цитоплазмой (р16) и красным ядром (Ki-67). Так, в крупномасштабном исследовании ATHENA (n=7727) было показано, что для выявления CIN 3+ чувствительность метода р16/Ki-67 была значительно выше Рар-цитологии (74,9% против 51,9%) [8]. По мнению ряда авторов, при первичном ВПЧ-скрининге цитологический метод двойного окрашивания рекомендуется использовать для отбора/дообследования (triage) ВПЧ-позитивных пациенток, поскольку он повышает чувствительность цитологии [8-10]. ВПЧ+/р16-позитивным женщинам показана немедленная кольпоскопия. Так, направление на кольпоскопию всех ВПЧ 16/18-позитивных женщин, а также р16/Ki67-позитивных при других генотипах ВПЧ высокого риска (non-16/18) позволило достичь повышения чувствительности для CIN 3+, составившей 86,8%. Учитывая очевидные преимущества, цитологический метод двойного окрашивания предлагается к внедрению в программы цервикального скрининга [11]. Результаты исследований последних лет показывают, что ВПЧ в стадии персистенции способствует возникновению не только предрака и рака шейки матки, но и рецидива CIN и злокачественного поражения шейки матки после лечения [12-15]. Возможные патогенетические механизмы рецидивирования заболевания в зависимости от варианта лечения предрака нуждаются в уточнении. Общеизвестен положительный опыт применения инозин пранобекса при CIN, ассоциированной с ВПЧ. Наряду с многочисленными исследованиями, которые посвящены оценке элиминации ВПЧ после лечения инозин пранобексом, новый подход в оценке его эффективности предусматривает изучение влияния инозин пранобекса на уровень маркеров клеточной активности и пролиферации. Цель исследования - определить динамику экспрессии р16, Ki-67 у больных с ВПЧ-ассоциированными CIN при комплексном лечении с применением инозин пранобекса (Изопринозина). Материалы и методы На I диагностическом этапе в исследование включены 62 женщины с цервикальной ВПЧ-инфекцией (средний возраст 26,4±6,13 года), среди которых основную группу (ОГ) составили 47 пациенток с верифицированной CIN, ассоциированной с ВПЧ высокого риска. Пациентки с CIN 1 составили ОГ 1 (n=21), с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями (squamous intraepithelial lesion - SIL) - CIN 2-CIN 3 - ОГ 2 (n=26). Выделены группа сравнения пациенток с латентной ВПЧ-инфекцией (n=15) и группа контроля (n=13). Критерии включения в ОГ 1: репродуктивный возраст, наличие позитивного цервикального ВПЧ-теста, SIL легкой степени (low grade SIL - LSIL) по данным цитологического исследования, гистологическая верификация CIN 1, иммуноцитохимическое исследование цервикального материала на р16, Ki-67. Критерии включения в ОГ 2: репродуктивный возраст, наличие позитивного цервикального ВПЧ-теста, наличие SIL по данным цитологического исследования, гистологическая верификация CIN 2, CIN 3, иммуноцитохимическое исследование цервикального материала на р16, Ki-67. Критерии включения в группу сравнения: репродуктивный возраст, позитивный ВПЧ-тест с типированием на 14 типов, отсутствие интраэпителиальных поражений (negative for intraepithelial lesion or malignancy - NILM) по данным цитологического исследования и отсутствие аномальных кольпоскопических картин, иммуноцитохимическое исследование цервикального материала на р16, Ki-67. Критерии включения в группу контроля: репродуктивный возраст, наличие негативного ВПЧ-теста, NILM по данным цитологического исследования, отсутствие цервикальной патологии. Информированное согласие пациенток являлось обязательным условием для участия в исследовании. Критерии исключения: несоответствующий возраст больных, беременность и лактация, рак шейки матки, отказ от участия в исследовании. На II этапе обследования ОГ были разделены в зависимости от лечения. ОГ 1 была разделена на две подгруппы: подгруппа 1А (n=7) включала пациенток, получавших монотерапию инозин пранобексом, 1Б (n=14) - комбинированное лечение: аблативное/эксцизионное + инозин пранобекс (Изопринозин) из расчета 50 мг/кг массы тела в сутки (1000 мг 3 раза в сутки) в течение 10 дней 2 курса. При CIN 1 тактика комбинированной терапии применялась у пациенток старше 35 лет, при невозможности регулярного наблюдения, кольпоскопической картины (неудовлетворительная, зона трансформации 3-го типа, большая площадь поражения и смешанные аномальные картины); в остальных случаях применялась медикаментозная терапия. ОГ 2 была также разделена на 2 подгруппы: подгруппа 2А (n=17) включала пациенток, получавших эксцизионное лечение (Loop Electosurgical Excision Procedure - LEEP или Large Loops Excision of the Transformation Zone - LLETZ) высокочастотным электрохирургическим аппаратом ЭХВЧ-80-02 «Фотек» (Россия) в сочетании с инозин пранобексом из расчета 50 мг/кг массы тела в сутки (1000 мг 3 раза в сутки) в течение 10 дней 2-3 курса с интервалом 14 дней; 2Б (n=9) - больных после эксцизионного лечения (LEEP или LLETZ) без медикаментозного компонента (n=9). Данное разделение было предпринято ввиду наличия в клинической практике как первого, так и второго подхода в лечении больных с CIN 2-3. Аблативное лечение в этих группах не применялось. Комплексная диагностика включала традиционные методы: цитологическое исследование (жидкостная цитология - Sure Path), кольпоскопическое исследование, гистологическое исследование цервикальных биоптатов и эндоцервикальных образцов - и дополнительные методы: метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени использовался для дифференцированного выявления и количественного определения ДНК ВПЧ-6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59; иммуноцитохимическое исследование - для определения р16, Ki-67 (тест-система CINtec) и двойного окрашивания маркеров р16/Ki-67 (тест-система CINtec PLUS Kit, Германия). Динамическое иммуноцитохимическое определение маркеров (р16 и Ki-67) осуществлялось дважды: до лечения и через 6 мес при CIN 1 и через 8-10 мес при CIN 2-3 после завершения лечения. Статистический анализ данных проводился с применением пакета Statistica-6, пакета EpiInfo (версия 3.3), возможностей MS Excel. Проверка нормальности распределения количественных признаков проводилась по критерию Шапиро-Уилка. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости р принимался равным 0,05. Данные в тексте представлены в виде M±SD, где M - среднее арифметическое, SD - стандартное отклонение средней. Для сравнения качественных показателей в группах использовались точный критерий Фишера, метод углового преобразования Фишера. В исследовании применялись анализ по Спирмену, информационная статистика Кульбака (2I-статистика). Результаты и обсуждение На I этапе исследования дана оценка экспрессии биомаркеров p16ink4а и Ki-67 среди пациенток с CIN 1, CIN 2-3 до лечения в сравнении с латентной формой ПВИ и группы контроля (n=75). Наряду с качественной (наличие позитивного теста) оценивались количественная составляющая экспрессии (диффузная и фокальная) в виде единичных клеток и гиперэкспрессии р16, а также коэкспрессия p16/ Ki-67 (табл. 1). Факт экспрессии р16 был установлен в группах ВПЧ-инфекции, ассоциированной с CIN, и без CIN (латентной формы), в отличие от пациенток группы контроля (рис. 1). Экспрессия р16 была установлена у большинства (69,2%) больных ОГ 2, у каждой третьей пациентки ОГ 1 (р=0,02), при латентной ВПЧ-инфекции (20%), но при ее отсутствии в группе контроля (р=0,001). У больных ОГ 2 доминировала гиперэкспрессия р16 как в сравнении со ОГ 1 (р=0,0002), так и с группой сравнения (р=0,0001) и группой контроля (р=0,001). В ОГ 2 преобладала экспрессия Ki-67 в сравнении с пациентками с CIN 1; р=0,003 (рис. 2), с латентной формой ПВИ (р=0,005) и группой контроля, в которой не зарегистрировано экспрессии Ki-67 ни в одном случае (р=0,001). Коэкспрессия p16ink4а и Ki-67 также доминировала в ОГ 2 (50%) относительно ОГ 1 (10%) и группы сравнения (6,7%); р=0,003, р=0,005 соответственно (рис. 3). В группе контроля изолированное и двойное окрашивание маркеров отсутствовало. Итак, сравнительный анализ позволил установить отсутствие различий в экспрессии р16, Ki-67 и коэкспрессии при ВПЧ-ассоциированной CIN 1 относительно латентной ВПЧ-инфекции и женщин без цервикальной патологии. CIN 2-3 характеризовалась статистически значимым преобладанием уровня биомаркеров не только в сравнении с латентной инфекцией, но и с CIN 1, что обосновывает выбор активной тактики ведения. Установлены корреляционная зависимость между степенью CIN и р16 (rs=+0,43; р<0,001), между степенью CIN и Ki-67 (rs=+0,38; р<0,001), связь между степенью CIN и коэкспрессией р16 и Ki-67 (rs=+0,38; р<0,001). На небольшой выборке нашего исследования была определена диагностическая значимость биомаркеров при ВПЧ-ассоциированных CIN (табл. 2). Акцент исследования на следующем этапе был поставлен на изучении влияния инозин пранобекса на уровень экспрессии биомаркеров при CIN 2-3. Поэтому на II этапе исследования каждая ОГ была разделена на две в зависимости от метода лечения CIN. Для оценки действия инозин пранобекса на уровень экспрессии (подгруппа 2А) проведен анализ показателей анамнеза, данных генотипирования ВПЧ в двух подгруппах больных с CIN 2-3 (2А и 2Б). Обе группы исследования были сопоставимы по анамнестическим данным, включая возраст (M±SD): 29,20±1,41 и 28,85±1,47 года (p=0,992); социальный статус (р=0,571); интервал между возрастом менархе и половым дебютом (p=0,219); курение (р=0,384); частоту лечения шейки матки (р=0,258); частоту инфекций, передаваемых половым путем, в анамнезе (р=0,340); использование барьерной контрацепции (р=0,471). Сравнительная оценка генотипирования ВПЧ свидетельствовала о преобладании в обеих группах 16-го типа. Различия в группах по структуре типов ВПЧ статистически незначимы (2I=0,26; р>0,05). Первоначальные данные иммуноцитохимического исследования не имели статистически значимых различий в двух группах при CIN 1 и CIN 2-3 (табл. 3). Однако после лечения картина менялась. Результаты иммуноцитохимического исследования биомаркеров через 6 мес при CIN 1 и через 8-10 мес после лечения CIN 2-3 представлены в табл. 4, 5. В подгруппе 1А после монотерапии инозин пранобексом зафиксированы единичные случаи выявления биомаркеров, которые не являлись показательными и после лечения, сохраняясь на том же уровне, аналогично - в подгруппе 1Б (аблативное лечение + инозин пранобекс), за исключением снижения экспрессии р16 (р=0,02). В подгруппе 2А на фоне лечения инозин пранобексом отмечено статистически значимое 9-кратное снижение числа пациенток с экспрессией p16/Ki-67 после лечения. В подгруппе 2Б пациенток эксцизионное лечение (LEEP или LLETZ) приводило к снижению экспрессии p16/Ki-67 (в 1,3 раза), однако данные не являлись статистически значимыми (рис. 4). Выявленные различия позволяют расценивать подобные изменения как патогенетические предпосылки для риска отдаленного рецидивирования заболевания при отсутствии противовирусного компонента лечения. Анализируя исходные данные по состоянию экспрессии биомаркеров, можно сделать заключение о повышении частоты экспрессии р16 и Ki-67, их коэкспрессии при CIN 2-3 в отличие от пациенток с CIN 1, латентной инфекцией и здоровых женщин (р<0,001). Детекция симультанной гиперэкспрессии биомаркера р16 и маркера клеточной пролиферации Ki-67 в клетках цервикального эпителия является индикатором дисрегуляции клеточного цикла и наличия CIN и оправдана в первичном скрининге при CIN 2+. Сохранение экспрессии р16/Ki-67 в клетках цервикального эпителия является следствием сохраняющихся нарушений клеточного цикла и повышенной пролиферативной способности эпителиоцитов экзоцервикса у пациенток с CIN 2-3 после эксцизионного лечения. Полученные данные при отсутствии противовирусного лечения позволяют высказать предположение о существующем риске рецидивирования CIN в последующем на фоне персистенции ВПЧ и прогнозировать, таким образом, неблагоприятное течение заболевания. Выводы 1. При ВПЧ-ассоциированной CIN 1 не установлено различий в экспрессии р16, Ki-67, р16/Ki-67 в цервикальном эпителии в сравнении с латентной ВПЧ-инфекцией и группой контроля. 2. Среди пациенток с CIN высокой степени, ассоциированной с ВПЧ высокого риска, повышена частота иммуноцитохимического подтверждения экспрессии р16/Ki-67 в сравнении с пациентками с CIN 1, что обосновывает необходимость противовирусного лечения в сочетании с эксцизионным. 3. Комплексное лечение пациенток с ВПЧ-ассоциированными CIN 2-3 на основе комбинации эксцизионного и противовирусного компонентов (Изопринозин) способствует снижению экспрессии р16/Ki-67 в цервикальном эпителии в отличие от пациенток после эксцизионного лечения без противовирусного компонента, повышая тем самым риск рецидивирования на фоне персистирующей ВПЧ-инфекции.

About the authors

T V Klinyshkova

Omsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: klin_tatyana@mail.ru
644099, Russian Federation, Omsk, ul. Lenina, d. 12

O N Mironova

Clinical Diagnostic Center

644024, Russian Federation, Omsk, ul. Ilinskaia, d. 9

References

Supplementary files