COMPLEXES OF CHAMAEDAPHNE CALYCULATA (L.) MOENCH FLAVONOIDS IN OLIGOTROPHIC BOGS OF THE MIDDLE OB RIVER

Full Text

Введение Исследования флавоноидов в растительном организме известны с начала XIX в. Интерес к флавоноидным соединениям особенно возрос в 40-е гг. прошлого столетия, флавоноиды привлекают внимание ученых разносторонней биологической активностью и чрезвычайно низкой токсичностью (Caniego 2005). После 1970 г. выделено свыше 1 500 соединений, относящихся к флавоноидам, но общее число флавоноидов и антоцианов очень велико и до сих пор неизвестно (Кабата-Пендиас 2005). История исследования и возможное применение данных по природным флавоноидам представили в своей работе Plant polyphenols: recent advances in epidemiological research and other studies on cancer prevention A. Valavanidis и T. Vlachogianni (2013). В настоящее время накопилось достаточно много материала по исследованию механизма накопления и свойств флавонов и других растительных продуктов, которые способны изменять стрессоустойчивость организмов. В.Е. Софронова (2010) рассмотрела растворимые фенольные соединения и устойчивость вечнозеленых растений к стрессовым факторам криолитозоны. В результате проведенной работы было установлено, что колебания в их содержании зависят от сроков прохождения фаз развития растений, температурно-световых условий произрастания. В работе рассматривается также и связь с флавоноидами. Martz F. (2010) с соавторами провел анализ листьев черники, собранных на открытых и лесных участках, показал, что основные фенольные изменения появились на первых этапах развития листьев, но, что наиболее важно, синтез и накопление флавоноидов в лесу были меньше по сравнению с участками с высокой освещенностью. Листья с более высоких широт и больших высот имели более высокий уровень растворимого фенола и флавонола, более высокую антиоксидантную способность и более низкое содержание производных хлорогеновой кислоты. А Berlim et al. (2018) представил данные по фотофизическим свойствам флавоноидов, извлеченных из Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland. Флавоноиды и антоцианы образуются в плодах и листьях вечнозеленых кустарничков и хвойных растениях, которые являются доминантами болотных экосистем Среднего Приобья. Флавоноиды являются физиологическими веществами для адаптации растений к холоду, ультрафиолетовому излучению, тяжелым металлам и многим другим неблагоприятным факторам среды обитания, повышают их стрессоустойчивость. Сложные условия для выживания в болотных экосистемах требуют от растений активизации большого набора адаптаций, среди которых флавоноиды и антоцианы играют важную роль (Баширова 1998, Фурса, Горькова 2013). На сегодняшний день принципы экологической регуляции флавоноидов и антоцианов слабо изучены, и до настоящего времени не проводились исследования спектров синтезируемых вечнозелеными растениями флавоноидов и антоцианов в условиях Среднего Приобья. Целью представленного исследования явилось определение факторов изменчивости спектров флавоноидов у Chamaedaphne calyculata (L.) Moench. олиготрофных болот Среднего Приобья. Для того, чтобы понять принципы регуляции синтеза флавоноидов, необходимо оценить основные факторы и силу их влияния на биосинтез. Объекты и методы исследования Объект исследования - Chamaedaphne calyculata (L.) Moench. Для анализа был выбран болотный контур с экологически однородными условиями. Природная однородность условий определяли по ряду параметров: 1) бессточное болото без притока воды из других ландшафтов, а перемещения водных потоков в границах болота носят хаотичный характер под влиянием температуры, ветра, таяния снегов и т. п.; 2) верховые болота по определению не имеют притока питательных веществ, кроме вымывания подпочвенного субстрата. Вымывание практически прекращается по мере нарастания торфа, и растения на поверхности получают ресурсы из разлагающихся торфяных масс. Зольность почв в пределах 2-5%; 3) растительность выбранного участка однородная (Овечкина 2017; Иванов 2017). Для исследования были отобраны растения из пяти опытных участков, расположенных на Самотлорском лицензионном участке, и одного контрольного участка, расположенного в районе учебно-полевой базы Нижневартовского государственного университета «Церковная грива». Образцы почвогрунтов отбирали по ГОСТ Р 53123-2008 (ИСО 10381-5:2005) методом конверта. Листья для анализа отбирали в июне. Брали листья со среднего яруса растений, с 6-кратной повторностью. Число и вес листьев определяли с участков 25х25 см. Полученные с каждого участка образцы растений анализировались в 3 повторностях. Всё растительное сырье было высушено до воздушно-сухого состояния, измельчено до размеров частиц не более 2 мм. Экстракцию производили из навески в 20 мг поэтапно: гексаном (в три приема общим объемом растворителя 100 мл), после выпаривания гексана растительное волокно экстрагировали 70%-ным этанолом (в три приема, объединяя отфильтрованные с помощью фильтров Шотта экстракты). Применение гексана в качестве предварительного экстрагента было вызвано необходимостью избавить образцы от различного рода неполярных органических веществ, не имеющих отношение к фенольным метаболитам. В дальнейшем при анализе образцов методом ВЭЖХ данные экстракты не анализировались. Подготовку растительного сырья проводили в два этапа: для очистки растительного сырья от жирорастворимой фракции использовали гексан. Растительное сырье трижды инкубировали с гексаном по 15 минут при непрерывном встряхивании, фильтровали через фильтры Шота. После растительное сырье инкубировали в течение 45 минут в 70%-ном водном растворе этанола трижды, отфильтровывая и объединяя полученные экстракты. Упаривали на водяной бане до получения концентрированного раствора, раствор высушивали до получения постоянной сухой массы. В качестве базовых методов в исследовании были использованы: морфологический анализ вечнозеленых растений; метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ); метод градиентной статистики; фрактальный анализ; подходы исследования динамического хаоса в факториальной экологии; фотоколориметрический метод, с использованием атомно-абсорбционного спектрофотометра МГА-915 и вольтамперометрического комплекса СТА; картографический; дешифрирования космо- и аэрофотоматериалов. Исследования содержания P, N, Cd, Pb, Cu, Zn проводили параллельно в почве исследуемых участков и листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench. Такой подход позволил рассчитать коэффициенты накопления исследованных элементов в растительных тканях и определить интенсивность их накапливания. Методом ВЭЖХ хроматографии определяли спектры метаболомов, содержащих флавоноиды и вещества с близкими физико-химическими свойствами, из ценопопуляций Chamaedaphne calyculata (L.) Moench. Для анализа отбирали взвешенное количество экстрагированного образца, растворяя его в элюенте 50:50 вода-ацетонитрил. Хроматографический анализ проводили методом ВЭЖХ на хроматографе Waters «Breeze». Хроматографическое исследование экстрактов образцов листьев проводили в режиме обратной фазы на колонке Luna C18 250×4,6 мм, 5 мкм. В ходе анализа использовались стандарты веществ: байкалеин, гесперетин, физетин, нарингин, нарингенин, рутин, кверцетин, изокверцетин, морин, дигидрокверцетин, ликвиритигенин производства Sigma-Aldrich, чистотой не менее 92%. Стандарты соответствующих флавоноидов и сами вещества в образцах детектировались при длинах волн 275 и 360 нм на диодно-матричном УФ-анализаторе. Стандарты и вещества в образцах детектировались при длине волны 360 нм на базе УНЦ ИОХ РАН (Уфа). При проведении анализа применялось соотношение растворителей: вода: ацетонитрил: трифторуксусная кислота (ТФА) = 35:64,9:01. Индивидуальные образцы растений анализировались в трех повторностях при двух аналитических длинах волн. Хроматограмму «единичного» экстракта стандартного образца растительного материала, усредненную по трем аналитическим прогонам, принимали за элементарную единицу иерархии. В каждой ценопопуляции анализировали по 10-15 хроматограмм. Хроматограммы оценивали по трем основным параметрам: 1) время выхода пика, что указывает на наличие того или иного вещества; 2) число пиков за время хроматографирования, что указывает на общее количество веществ в экстракте; 3) площадь пиков, что указывает на относительное содержание данного вещества в данном экстракте. Результаты и обсуждение Результаты содержания исследованных химических элементов в почвенных образцах корнеобитаемых участков растений олиготрофного болота представлены на рисунке 1. Рис. 1. Относительная изменчивость содержания химических элементов в почвенных образцах корнеобитаемых участков растений в геоботанически и экологически однородном олиготрофном болоте Химический анализ почвогрунтов показал: 1. Почвы бедные минеральными элементами, что соответствует общепринятым представлениям (Аитов 2013; Иванов 2016). 2. Корнеобитаемые объемы различаются между собой: на общем олиготрофном фоне каждое растение может оказаться в отличающихся от других условиях корневого питания (Федоровский 1979; Мавлетова-Чистякова 2017). 3. По отношению к каждому элементу растение может выполнять функции биологического накопителя или иметь комплекс адаптаций для выполнения барьерной функции (Семенова 2012). Результаты исследования коэффициента накопления химических элементов в листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench представлены в таблицах 1-3. Исследование содержания химических элементов в почве и растительных тканях позволил рассчитать коэффициенты их накопления в растительных тканях. Chamaedaphne calyculata (L.) Moench адаптирован к существованию в сверхбедных почвогрунтах. Данная адаптация проявляется в способности концентрировать биогенные элементы в тканях, в частности, в листьях (Усманов 1987; Walch-Liu 2006). Как видно из таблицы 1, Chamaedaphne calyculata (L.) Moench устойчиво накапливает фосфор в концентрациях выше, чем отмечается их содержание в почве. Следует отметить, что коэффициент накопления фосфора в листьях примерно в 1,5 раза выше, чем для азота. Исследования показывают, что для биогенных элементов Chamaedaphne calyculata (L.) Moench является накопителем. Таблица 1 Содержание биогенных элементов P и N в почве, листьях и расчет коэффициента их накопления в листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench, мг/г P N Почва Лист Коэффициент накопления Почва Лист Коэффициент накопления 1,7 2,42 1,42 10,70 10,40 0,97 1,5 2,59 1,73 8,94 10,80 1,21 1,8 2,40 1,33 9,50 10,10 1,06 1,7 2,30 1,35 11,30 10,20 0,90 1,7 3,10 1,82 10,70 7,80 0,73 2,0 2,90 1,45 12,00 10,50 0,88 Таблица 2 Содержание биогенных элементов Сd и Pb в почве, листьях и расчет коэффициента их накопления в листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench, мг/г Сd Pb Почва Лист Коэффициент накопления Почва Лист Коэффициент накопления 0,47 0,08 0,17 7,66 0,52 0,07 0,49 0,08 0,17 6,42 0,45 0,07 0,02 0,08 4,74 6,60 0,46 0,07 0,29 0,03 0,10 8,21 0,21 0,03 0,29 0,01 0,04 7,38 0,80 0,11 0,17 0,01 0,07 8,73 0,84 0,10 Кадмий и свинец относятся к металлам, накопление которых нежелательно в продуктах питания. Во всех случаях коэффициент накопления кадмия очень низок и составляет около 5-10%, что в 10-15 раз ниже, чем для биогенных элементов. Выпадающее значение в строке 3 необходимо проверить в летних экспериментах: видимо, ошибка в оценке концентрации в почве. Как и в случае с Cd, значения коэффициента накопления очень невелики. Chamaedaphne calyculata (L.) Moench в данном случае показывает выраженную барьерную функцию к данным химическим элементам. Таблица 3 Содержание биогенных элементов Cu и Zn в почве, листьях и расчет коэффициента их накопления в листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench, мг/г Cu Zn Почва Лист Коэффициент накопления Почва Лист Коэффициент накопления 3,32 2,30 0,69 35,36 13,76 0,39 1,43 2,20 1,54 42,01 13,89 0,33 0,72 2,75 3,81 36,64 29,02 0,79 0,20 2,15 10,94 89,51 26,72 0,30 0,54 3,70 6,81 24,59 35,28 1,43 1,20 0,72 0,60 25,00 16,25 0,65 Результаты исследования показывают, что коэффициенты накопления меди и цинка в листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench достаточно высоки. На следующих стадиях работы необходимо сравнить накопление меди в листьях других вечнозеленых растений олиготрофных болот. Барьерная функция не выражена. Коэффициенты корреляции между концентрациями веществ в почвогрунте и листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench представлены в таблице 4. Таблица 4 Коэффициенты корреляции концентрции веществ в почве и листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 1,00 2 1,00 3 0,89 1,00 4 -0,84 1,00 5 0,82 1,00 6 -0,66 0,60 1,00 7 1,00 8 0,77 1,00 9 0,94 0,62 0,88 1,00 10 0,61 1,00 11 0,72 1,00 12 0,83 1,00 13 0,93 1,00 14 1,00 15 -0,83 1,00 16 -0,83 -0,94 0,59 1,00 17 -0,83 -0,83 0,92 1,00 18 0,73 -0,83 1,00 19 0,65 -0,89 1,00 Примечание: 1 - содержание Р в почве, мг/г; 2 - содержание Р в листьях, мг/г; 3 - коэффициент накопления Р; 4 - содержание Cd в почве, мг/кг; 5 - содержание Cd в листьях, мг/кг; 6 - коэффициент накопления Cd; 7 - содержание Pb в почве, мг/кг, 8 - содержание Pb в листьях, мг/кг; 9 - коэффициент накопления Pb; 10 - содержание N в почве, мг/г; 11 - содержание N в листьях, мг/г; 12 - коэффициент накопления N; 13 - содержание Cu в почве, мг/кг; 14 - содержание Cu в листьях, мг/кг,15 - коэффициент накопления Cu; 16 - содержание Zn в почве, мг/кг, 17 - содержание Zn в листьях, мг/кг; 18 - коэффициент накопления Zn; 19 - содержание флавоноидов в листьях, % от их сухой массы. Результаты исследования показывают, что химические элементы в листьях Chamaedaphne calyculata (L.) Moench накапливаются с разной интенсивностью. Вечнозеленое растение олиготрофных болот Среднего Приобья Chamaedaphne calyculata (L.) Moench интенсивно накапливает в листьях фосфор и азот, а тяжелые металлы не накапливаются вследствие сформированного комплекса адаптаций для выполнения барьерной функции. Данное положение в наибольшей степени относится к кадмию и свинцу, а в наименьшей - к меди и цинку. В системе почва-растение предварительно выявлены следующие взаимосвязи: 1. В олиготрофных геоботанически однородных болотных почвогрунтах отмечаются микрофлуктуации по всем исследованным элементам. 2. По отношению к разным исследованным химическим элементам вечнозеленые растения Среднего Приобья проявляют специфические способности к накоплению: - биогенные элементы, фосфор и азот, активно накапливаются в растениях; - кадмий и свинец сталкиваются с выраженной барьерной функцией со стороны растений; - медь и цинк не проявляют выраженного накопления или отторжения. 3. Растения комфортно развиваются (растут и плодоносят) в условиях олиготрофных болот Среднего Приобья. 4. Расчет значений корреляций показывает, что связи между процессами накопления исследованных химических веществ в растениях слабо выражены. 5. Валовое содержание флавоноидов не образует достоверных связей ни с одним из исследованных параметров в почве и растениях. Анализ суммы параметров почвы (6 показателей) показал, что положение образца как совокупности из 6 веществ не образует линейной структуры в зависимости от концентрации того или иного вещества (Мавлетова-Чистякова 2017). Результаты исследования экстрактов Chamaedaphne calyculata (L.) Moench методом ВЭЖХ показали, что в каждом растительном образце выявляется большое число веществ, от 21 до 41 (рис. 2, 3, табл. 5). 5 4 3 1 2 Рис. 2. Хроматограмма экстракта листьев Chamaedaphne calyculata (L.) Moench: по оси х - интенсивность сигнала, по оси y - время выхода пика, min; 1-5 - пики, идентифицированные по стандартам: 1. нарингин, время высвобождения пика - 10,30 min; 2. рутин - 10,59 min; 3. дегидрокверцетин - 11,94 min; 4. физетин - 13,397 min; 5. кверцитин - 15,458 min Рис. 3. Спектры флавоноидов Chamaedaphne calyculata (L.) Moench Результаты исследования хроматограмм спиртовых экстрактов вечнозеленых растений Среднего Приобья показывают, что в разных популяциях одного и того же растения наблюдается разное количество пиков хроматограмм, а значит разное количество веществ в растительных тканях или их качественное состояние. Для хроматограмм Chamaedaphne calyculata (L.) Moench число пиков для всех исследованных растений составило 108, что отлично от других наших исследований, описанных в литературе: Oxycoccus palustris - 76, для степных видов Juniperus sabina - 107, для Glycirrhiza korshinskyi - 114 (Usmanov 2019; Мавлетова-Чистякова 2017). Таблица 5 Иерархия хроматограмм для 5 уровней комбинации Уровни суммирования/объединения хроматограмм Растения/группы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Число пиков у отдельных растений 36 41 34 33 30 34 32 28 21 Число пиков для 2 объединенных хроматограмм 44 39 46 41 Хроматограммы сгруппированы по 3 54 49 43 Массив хроматограмм разделен на 2 75 69 Суммарное число пиков для всех хроматограмм исследованной ценопопуляции 108 Исследования показали, что хроматограммы спиртовых экстрактов растения Chamaedaphne calyculata (L.) Moench в разных популяциях кардинально различаются между собой, что указывает на разное количество или качество веществ в растении. Каждое растение практически имеет индивидуальные особенности по разнообразию фиксируемых веществ. В ходе исследования выявлено, что растительные организмы имеют следующие качественные различия: 1) общим свойством хроматограмм является высокая гетерогенность и низкий уровень сходства; 2) сумма веществ в ценопопуляциях всегда больше, чем в любой зарегистрированной хроматограмме. Полученные факты указывают на высокую вероятность участия нейтралистских механизмов в формировании спектров флавоноидов исследованных естественных ценопопуляций (Усманов 2015, 2019). Сравнение хроматограмм как комплексных последовательностей методом главных компонент (Розенберг 2013) показал, что сумма влияния экологических факторов по обеим комплексным осям не превышает 40%, что указывает на большую долю неучитываемых регуляторов (более 60%) (рис. 4). Рис. 4. Анализ меры сходства хроматограмм в пространстве метода главных компонент Корреляционный анализ результатов исследования показал на очень низкий уровень взаимозависимостей между расположением пиков, их числом и величиной. Анализ сходства распределений пиков в хроматограммах с помощью коэффициента Коха также показал на низкие значения сходства между пулами веществ в ценопопуляциях - от 0,03 до 0,18, что указывает на очень низкий уровень сходства хроматограмм (Щербаков 2013). Такие особенности хроматограмм позволили предположить, что система биосинтеза флавоноидов обладает свойствами стохастического фрактала: случайное распределение пиков в отдельной хроматограмме воспроизводится в других хроматограммах, в том числе при наложении хроматограмм по 2, 3 и т. д. Во всех случаях коэффициенты корреляции и коэффициенты сходства минимальны (Martin 2005; Milne 1991). После проведения вычислительных процедур фрактального анализа (Гелашвили 2013; Usmanov 2016; Andreson 1995) было доказано, что состав любой хроматограммы в измеренном интервале имеет стохастические свойства, слабо зависит от колебаний условий среды и определяется комплексом генетических, физиологических и экологических факторов (Усманов 2014, 2016; Usmanov 2017; Иванов 2017). Совокупность полученных данных позволяет в качестве основной гипотезы рассматривать суммы флавоноидов вечнозеленых растений олиготрофных болот Среднего Приобья как уникальный региональный продукт, антиоксидантные, антивоспалительные, антиаллергенные свойства которого целесообразно изучить более подробно. Заключение Результаты проведенных исследований позволяют сделать обобщенные выводы: 1. Флавоноидный спектр Chamaedaphne calyculata (L.) Moench содержит от 20 до 60 разных соединений у всех исследованных растений. 2. Флавоноиды обнаруживаются в больших количествах на всех этапах сезонных изменений. 3. Характер распределения спектров флавоноидов носит сложный многофакторный характер и не может быть однозначно интерпретирован как зависимость от того или иного фактора. 4. Получены доказательства того, что в распределении флавоноидов определяющую роль играют стохастические процессы, а регулирующие факторы биогенной и абиогенной природы имеют второстепенное значение. 5. Сумма флавоноидов растения Chamaedaphne calyculata (L.) Moench, произрастающего на олиготрофных болотах Западной Сибири, обеспечивает ему адаптивные преимущества в условиях многофакторного лимитирования роста высших растений листопадных видов.

About the authors

I. Yu Usmanov

Nizhnevartovsk State University; Ufa State Petroleum Technological University

Doctor of Biological Sciences, Professor, Chief Researcher

E. R Yumagulova

Nizhnevartovsk State University

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor

V. V Aleksandrova

Nizhnevartovsk State University

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor

I. G Gonchar

Nizhnevartovsk State University

Postgraduate Student

A. V Scherbakov

Bachincom LLC

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Leading Researcher

V. B Ivanov

Nizhnevartovsk State University

Candidate of Pedagogical Sciences, Associcate Professor

References

Supplementary files