Адаптация протокола автоматического твердофазного фосфитамидного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов для получения их N-незамещенных амидофосфатных аналогов (P-NH2)

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Предложен новый подход к автоматизированному синтезу N-незамещенных амидофосфатных олигодезоксирибонуклеотидов (P-NH2), основанный на оптимизированном протоколе твердофазного фосфитамидного синтеза с использованием реакции Штаудингера. Показано быстрое и эффективное окисление модельных P(III)-содержащих фосфиттриэфиров органическим азидом – (9-флуоренил)-метоксикарбонилазидом (FmocN3) – до соответствующих фосфамидов –(OPO(OR)(NFmoc))–, где R – остатки нуклеозидной или алкильной природы. Удаление щелочелабильной флуоронильной группы с модифицированного межнуклеозидного звена позволяет получать в цепи олигонуклеотида электронейтральные (при физиологических условиях pH ~ 7) N-незамещенные амидофосфатные остатки (–(OPO(O)(NH2))– или (P-NH2)) вместо классических отрицательно заряженных фосфодиэфиров (–(OPO(O)(O¯))–) или (P-O)). При оптимизации синтетического протокола продемонстрировано, что для повышения эффективности синтеза P-NH2-олигонуклеотидов (до ~80% на модифицированное звено) необходимо включение в протокол автоматического синтеза дополнительной стадии отщепления Fmoc-группы после проведения каждой стадии окисления растущей цепи олигомера по реакции Штаудингера. Показано практически полное отсутствие зависимости выхода P-NH2-олигонуклеотидов как от локализации P-NH2-звена в цепи, так и от типа модифицируемого динуклеотидного фрагмента. Получен набор моно- и бис-модифицированных октадезоксирибонуклеотидов и проведено детальное исследование термической стабильности комплементарных ДНК/ДНК-комплексов в различных буферных условиях. Показано, что в условиях высокой ионной силы раствора (1 M NaCl, pH 7.2) введение одного P-NH2-звена снижает термостабильность комплекса ДНК в среднем на 1.3°С. При уменьшении ионной силы раствора дестабилизирующий эффект P-NH2-модификации достоверно снижается, что дополнительно подтверждает электронейтральный статус вводимого амидофосфатного звена. Таким образом, нами разработан протокол получения частично модифицированных производных олигонуклеотидов, несущих незаряженные, но изоструктурные к нативным P-O-звеньям амидофосфатные остатки P-NН2.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. А. Малова

ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины” Сибирского отделения РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: malova.ev.an@gmail.com
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8

И. А. Пышная

ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины” Сибирского отделения РАН

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8

М. И. Мещанинова

ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины” Сибирского отделения РАН

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8

Д. В. Пышный

ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины” Сибирского отделения РАН

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8

Список литературы

  1. Knouse K., Flood D., Vantourout J., Schmidt M., McDonald I., Eastgate M., Baran P. // ACS Cent. Sci. 2021. V. 7. P. 1473–1485. https://doi.org/10.1021/acscentsci.1c00487
  2. Benner S., Hurter D. // Bioorg. Chem. 2002. V. 30. P. 62–80. https://doi.org/10.1006/bioo.2001.1232
  3. Agrawal S. // Trends Biotechnol. 1996. V. 14. P. 376–387. https://doi.org/10.1016/0167-7799(96)10053-6
  4. Duffy K., Arangundy-Franklin S., Holliger P. // BMC Biol. 2020. V. 18. P. 112. https://doi.org/10.1186/s12915-020-00803-6
  5. Oberemok V., Laikova K., Repetskaya A., Kenyo I., Gorlov M., Kasich I., Krasnodubets A., Gal’chinsky N., Fomochkina I., Zaitsev A., Bekirova V., Seidosmanova E., Dydik K., Meshcheryakova A., Nazarov S., Smagliy N., Chelengerova E., Kulanova A., Deri K., Subbotkin M., Useinov R., Shumskykh M., Kubyshkin A. // Molecules. 2018. V. 23. P. 1302. https://doi.org/10.3390/molecules23061302
  6. Clavé G., Reverte M., Vasseur J.-J., Smietana M. // RSC Chem. Biol. 2021. V. 2. P. 94–150. https://doi.org/10.1039/D0CB00136H
  7. Kandasamy P., Liu Y., Aduda V., Akare S., Alam R., Andreucci A., Boulay D., Bowman K., Byrne M., Cannon M., Chivatakarn O., Shelke J.D., Iwamoto N., Kawamoto T., Kumarasamy J., Lamore S., Lemaitre M., Lin X., Longo K., Looby R., Marappan S., Metterville J., Mohapatra S., Newman B., Paik I.H., Patil S., Purcell-Estabrook E., Shimizu M., Shum P., Standley S., Taborn K., Tripathi S., Yang H., Yin Y., Zhao X., Dale E., Vargeese C. // Nucleic Acids Res. 2022. V. 50. P. 5401–5423. https://doi.org/10.1093/nar/gkac037
  8. Egli M., Manoharan M. // Nucleic Acids Res. 2023. V. 51. P. 2529–2573. https://doi.org/10.1093/nar/gkad067
  9. de la Torre B., Albericio F. // Molecules. 2023. V. 28. P. 1038. https://doi.org/10.3390/molecules28031038
  10. Nielsen P. // Mol. Biotechnol. 2004. V. 26. P. 233–248. https://doi.org/10.1385/MB:26:3:233
  11. Nielsen P. // Chem. Biodivers. 2010. V. 7. P. 786–804. https://doi.org/10.1002/cbdv.201000005
  12. Arangundy-Franklin S., Taylor A., Porebski B., Genna V., Peak-Chew S., Vaisman A., Woodgate R., Orozco M., Holliger P. // Nat. Chem. 2019. V. 11. 533– 542. https://doi.org/10.1038/s41557-019-0255-4
  13. Peyrottes S. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 1841– 1848. https://doi.org/10.1093/nar/24.10.1841
  14. Chubarov A.S., Oscorbin I.P., Novikova L.M., Filipenko M.L., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V. // Diagnostics. 2023. V. 13. P. 250. https://doi.org/10.3390/diagnostics13020250
  15. Dong Z., Chen X., Zhuo R., Li Y., Zhou Z., Sun Y., Liu Y., Liu M. // BMC Biol. 2023. V. 21. P. 95. https://doi.org/10.1186/s12915-023-01599-x
  16. Sarkar S. // Biopolymers. 2023. V. 115. P. e23567. https://doi.org/10.1002/bip.23567
  17. Lomzov A.A., Kupryushkin M.S., Dyudeeva E.S., Pyshnyi D.V. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 461–468. https://doi.org/10.1134/S1068162021020151
  18. Summerton J. // Int. J. Pept. Res. Ther. 2003. V. 10. P. 215–236. https://doi.org/10.1007/s10989-004-4913-y
  19. Bhadra J., Pattanayak S., Sinha S. // Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2015. V. 62. P. 4.65.1–4.65.26. https://doi.org/10.1002/0471142700.nc0465s62
  20. Braasch D., Nulf C., Corey D. // Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2002. V. 9. P. 4.11.1–4.11.18. https://doi.org/10.1002/0471142700.nc0411s09
  21. Kostov O., Páv O., Rosenberg I. // Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2017. V. 70. P. 4.76.1–4.76.22. https://doi.org/10.1002/cpnc.35
  22. Micklefield J. // Curr. Med. Chem. 2001. V. 8. P. 1157– 1179. https://doi.org/10.2174/0929867013372391
  23. Lee H., Jeon J., Lim J., Choi H., Yoon Y., Kim S. // Org. Lett. 2007. V. 9. P. 3291–3293. https://doi.org/10.1021/ol071215h
  24. Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., Стеценко Д.А. // Act. Nat. 2014. Т. 6. C. 116–118. https://doi.org/10.32607/20758251-2014-6-4-116-118
  25. Kuznetsov N.A., Kupryushkin M.S., Abramova T.V., Kuznetsova A.A., Miroshnikova A.D., Stetsenko D.A., Pyshnyi D.V., Fedorova O.S. // Mol. Biosyst. 2016. V. 12. P. 67–75. https://doi.org/10.1039/c5mb00692a
  26. Новопашина Д.С., Назаров А.С., Воробьева М.А., Купрюшкин М.С., Давыдова А.С., Ломзов А.А., Пышный Д.В., Altman S., Веньяминова А.Г. // Мол. биология. 2018. T. 52. С. 1045–1054. https://doi.org/10.1134/S0026898418060137
  27. Garafutdinov R.R., Sakhabutdinova A.R., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. // Biochimie. 2020. V. 168. P. 259–267. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.11.013
  28. Markov A.V., Kupryushkin M.S., Goncharova E.P., Amirkhanov R.N., Vasilyeva S.V., Pyshnyi D.V., Zenkova M.A., Logashenko E.B. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 774–782. https://doi.org/10.1134/S1068162019060268
  29. Chubarov A.S., Oscorbin I.P., Filipenko M.L., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V. // Diagnostics. 2020. V. 10. P. 872. https://doi.org/10.3390/diagnostics10110872
  30. Pavlova A.S., Yakovleva K.I., Epanchitseva A.V., Kupryushkin M.S., Pyshnaya I.A., Pyshnyi D.V., Ryabchikova E.I., Dovydenko I.S. // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. P. 9784. https://doi.org/10.3390/ijms22189784
  31. Kupryushkin M.S., Filatov A.V., Mironova N.L., Patutina O.A., Chernikov I.V., Chernolovskaya E.L., Zenkova M.A., Pyshnyi D.V., Stetsenko D.A., Altman S., Vlassov V.V. // Mol. Ther. Nucleic Acids. 2022. V. 27. P. 211–226. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2021.11.025
  32. Stetsenko D., Kupryshkin M., Pyshnyi D. // Int. Application WO2016028187A1, 2016.
  33. Froehler B. // Tetrahedron Lett. 1986. V. 27. P. 5575– 5578. https://doi.org/10.1016/S0040-4039(00)85269-7
  34. Iyer R., Devlin T., Habus I., Yu D., Johnson S., Agrawal S. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 1543–1546. https://doi.org/10.1016/0040-4039(96)00067-6
  35. Peyrottes S., Vasseur J.-J., Imbach J., Rayner B. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 5869–5872. https://doi.org/10.1016/0040-4039(96)01250-6
  36. Laurent A., Debart F., Rayner B. // Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. P. 5285–5288. https://doi.org/10.1016/S0040-4039(97)01153-2
  37. Devlin T., Iyer R., Johnson S., Agrawal S. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. V. 6. P. 2663–2668. https://doi.org/10.1016/S0960-894X(96)00498-2
  38. Peyrottes S., Vasseur J.-J., Imbach J.L., Rayner B. // Nucleosides and Nucleotides. 1997. V. 16. P. 1551– 1554. https://doi.org/10.1080/07328319708006227
  39. Iyer R., Yu D., Devlin T., Ho N.-H., Johnson S., Agrawal S. // Nucleosides and Nucleotides. 1997. V. 16. P. 1491–1495. https://doi.org/10.1080/07328319708006214
  40. Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В. // Заявка RU2014134383A, 2014.
  41. Paul S., Roy S., Monfregola L., Shang S., Shoemaker R., Caruthers M. // J. Am. Chem. Soc. 2015. V. 137. P. 3253–3264. https://doi.org/10.1021/ja511145h
  42. Prokhorova D.V., Chelobanov B.P., Burakova E.A., Fokina A.A., Stetsenko D.A. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2017. V. 43. P. 38–42. https://doi.org/10.1134/S1068162017010071
  43. Chelobanov B.P., Burakova E.A., Prokhorova D.V., Fokina A.A., Stetsenko D.A. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2017. V. 43. P. 664–668. https://doi.org/10.1134/S1068162017060024
  44. Kupryushkin M.S., Zharkov T.D., Ilina E.S., Markov O.V., Kochetkova A.S., Akhmetova M.M., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 719–733. https://doi.org/10.1134/S1068162021030110
  45. Carpino L., Han G. // J. Org. Chem. 1972. V. 37. P. 3404–3409. https://doi.org/10.1021/jo00795a005
  46. Bazhenov M.A., Shernyukov A.V., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 699–708. https://doi.org/10.1134/S1068162019060074
  47. Jiménez E.I., Gibard C., Krishnamurthy R. // Angew. Chemie Int. Ed. 2021. V. 60. P. 10775–10783. https://doi.org/10.1002/anie.202015910
  48. Preobrazhenskaya N.N. // Russ. Chem. Rev. 1972. V. 41. P. 54–65. https://doi.org/10.1070/RC1972v041n01ABEH002030
  49. Johnsson R., Bogojeski J., Damha M. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014. V. 24. P. 2146–2149. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2014.03.032
  50. Gololobov Y.G., Zhmurova I.N., Kasukhin L.F. // Tetrahedron. 1981. V. 37. P. 437–472. https://doi.org/10.1016/S0040-4020(01)92417-2
  51. Jones A. // Int. J. Biol. Macromol. 1979. V. 1. P. 194–207. https://doi.org/10.1016/0141-8130(79)90013-8
  52. Boal J., Wilk A., Harindranath N., Max E., Kempe T., Beaucage S. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3115– 3117. https://doi.org/10.1093/nar/24.15.3115
  53. Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Pyshnaya I.A., Ivanova E.M. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2006. V. 23. P. 567–579. https://doi.org/10.1080/07391102.2006.10507082
  54. Преч Э., Бюльманн Ф., Аффольтер К. // Определение строения органических соединений. Таблицы спектральных данных. Москва: Мир, 2006. 439 с.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Дополнительные материалы
Скачать (989KB)
Метаданные
3. Рис. 1. ESI-MS-анализ соединения (V) (схема 1) в режиме регистрации положительных ионов.

Скачать (134KB)
Метаданные
4. Рис. 2. (а) – офВЭЖХ-анализ реакционных смесей гексатимидилатов (T*T5), полученных в разных условиях окисления по реакции Штаудингера и обработанных концентрированным водным аммиаком в течение 30 мин при 25°С. Градиент концентрации ацетонитрила 0–30% за 15 мин. Соотнесение пиков проводили по совокупности данных масс-спектрометрического анализа (рис. S4 в дополнительных материалах) и сравнения с контрольным олигонуклеотидом T6: пик 1 – Т5, пик 2 – Т6, пик 3 – T(–P(V)–NH2–)T5, пик 4 – T(–P(V)=N–Fmoc–)T5; (б) – условия окисления и степень протекания реакции Штаудингера без учета степени деструкции модифицированного звена, полученные как отношение суммы интегральных площадей пиков 3 и 4 к сумме интегральных площадей всех компонентов реакционной смеси (по данным офВЭЖХ).

Скачать (137KB)
Метаданные
5. Рис. 3. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях (8 М мочевина, 89 мМ Tris-боратный буфер, pH 8.3) реакционных смесей олигонуклеотидов T*T5, полученных по протоколу, описанному в табл. 1, с использованием 0.25 М раствора FmocN3 и продолжительностью окисления по реакции Штаудингера 45 мин в зависимости от последовательной постсинтетической обработки: 1, 2 – контрольные T5 и T6 соответственно; 3, 5 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин); 4 – детритилирование на CPG (3%-ная трихлоруксусная кислота в CH2Cl2, 2 мин), удаление Fmoc-группы на CPG (2%-ный раствор DBU в ацетонитриле, 5 мин), аммонолиз (метанольно-аммиачная смесь, 2 ч); 6 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин), дополнительный аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 24 ч); 7 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин), дополнительный аммонолиз (метанольно-аммиачная смесь, 24 ч). Отнесение основных пятен произведено по данным ESI-MS-анализа после выделения офВЭЖХ (рис. S5 в дополнительных материалах).

Скачать (88KB)
Метаданные
6. Рис. 4. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях (8 М мочевина, 89 мМ Tris-боратный буфер, pH 8.3) реакционных смесей: 1 и 2 – контрольные олигонуклеотиды T5 и T6 с природными фосфодиэфирными связями; 3 – T2*T4, полученный по способу 1; 4 – T2*T4, полученный по способу 2.

Скачать (179KB)
Метаданные
7. Рис. 5. Устойчивость P-NH2-олигонуклеотидов к деблокированию метанольно-аммиачной смесью по сравнению со стандартным удалением защитных групп с использованием концентрированного водного аммиака, определенная по данным офВЭЖХ.

Скачать (60KB)
Метаданные
8. Рис. 6. Схема эксперимента по оценке влияния стадии дополнительного окисления смесью I2/Py/H2O на соотношение побочных продуктов при синтезе P-NH2-олигонуклеотида. Оценку влияния проводили по данным офВЭЖХ.

Скачать (94KB)
Метаданные
9. Рис. 7. Вклад P-NH2-модификации в термическую стабильность (DT) комплементарных комплексов бисмодифицированных олигодезоксирибонуклеотидов с матрицей AGCTACCG в зависимости от ионной силы раствора относительно немодифицированного комплекса.

Скачать (122KB)
Метаданные
10. Схема 1. Стадии превращения тимидинамидофосфита при окислении FmocN3 по реакции Штаудингера с указанием 31P-ЯМР-характеристик, полученных в ходе эксперимента. Соединение (VI) не было зарегистрировано в ходе превращений и указано здесь как ожидаемый продукт с диапазоном химических сдвигов, представленным в литературе [41, 47].

Скачать (159KB)
Метаданные
11. Схема 2. Предполагаемый механизм гидролиза Fmoc-содержащего фрагмента на стадии детритилирования трихлоруксусной кислотой во время синтеза P-NH2-олигонуклеотидов.

Скачать (58KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024