Expediency of immunocytochemical study as a marker of proliferative activity in cervical intraepithelial neoplasia

Full Text

Проблема рака шейки матки (РШМ) в течение многих десятилетий продолжает оставаться в центре внимания ведущих зарубежных и отечественных онкологов. Злокачественные опухоли шейки матки занимают лидирующую позицию среди злокачественных новообразований органов репродуктивной системы у женщин, уступая лишь раку молочной железы, несмотря на гораздо более эффективный скрининг по сравнению с этим заболеванием [1, 2].

Если сегодня не проводить своевременные мероприятия по профилактике и лечению РШМ, то после 2050 г. им ежегодно в мире будет заболевать 1 млн женщин. В течение последнего десятилетия в России отмечают постепенный рост заболеваемости РШМ: среднегодовой прирост составил 2,21%, общий – 25,18%. РШМ является одной из нозологических форм, удовлетворяющих всем требованиям популяционного скрининга [1].

Цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CIN) – предраковое поражение, имеющее 3 степени выраженности (отражающие стадии развития изменений): дисплазия слабой степени (CIN I), дисплазия умеренной степени (CIN II) и дисплазия тяжелой степени (CIN III) [3, 4]. При отсутствии лечения CIN II или CIN III (в совокупности называемые H-SIL) в 75% случаев прогрессируют в РШМ [5].

В клинических рекомендациях Российского общества акушеров-гинекологов и Общероссийской общественной организации «Российское общество специалистов по профилактике и лечению опухолей репродуктивной системы» отмечено, что для дифференциальной диагностики степени тяжести поражения шейки матки целесообразно определять индекс пролиферативной активности экспрессии p16ink4a/Ki-67 в ходе иммуноцитохимического (ИЦХ) исследования [6].

На основании вышеизложенного, целью нашего исследования было оценить целесообразность ИЦХ-исследования как маркера пролиферативной активности при СIN II–III.

Материалы и методы

Мы провели комплексное обследование 78 женщин в возрасте от 25 до 45 лет, которых распределили на 2 группы в зависимости от верификации диагноза. В 1-ю группу вошли 39 пациенток с верифицированным диагнозом N87.1 «дисплазия умеренной степени тяжести» (CIN II); во 2-ю включили 39 пациенток с верифицированным диагнозом N87.2 «дисплазия тяжелой степени тяжести» (CIN III).

Мы проанализировали клинические и лабораторные данные пациенток 1 и 2-й групп, обследование которых проводили согласно клиническим рекомендациям 2020 г. [6]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени выполняли для определения сопутствующей условно-патогенной микрофлоры, а также инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Результаты цитологического исследования оценивали согласно классификационной системе Папаниколау в соотношении с классификацией Bethesda. Изменения на шейке матки, связанные с CIN I, CIN II и CIN III, соответствовали плоскоклеточным интраэпителиальным поражениям L-SIL и H-SIL.

Типирование вируса папилломы человека (ВПЧ) осуществляли с помощью ПЦР-теста «Квант 21». Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет быстро определить тип ВПЧ с количественной и качественной оценкой вирусной нагрузки и дифференцировать 21 генотип в исследуемом материале (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 44, 45, 51–53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82), включая высоко- и низкоонкогенные типы.

Абсолютный результат ВПЧ-нагрузки выражался в десятичных логарифмах (Lg): значение 3 соответствовало вирусной нагрузке 1000 копий вируса в образце:

• менее 3 Lg (ВПЧ/10×5 клеток) – ВПЧ указанных типов в организме есть, но количество вирусной нагрузки малозначимо, поэтому ВПЧ не может вызвать какие-либо заболевания;
• 3–5 Lg (ВПЧ/10×5 клеток) – клинически значимое количество ВПЧ, вирусной нагрузки достаточно, чтобы вызвать заболевание;
• более 5 Lg (ВПЧ/10×5 клеток) – повышенная вирусная нагрузка, есть высокий риск серьезных последствий.

Экспрессию белков р16ink4a и Ki-67 определяли с помощью ИЦХ-исследования соскобов шейки матки, включая жидкостную цитологию с окрашиванием по Папаниколау. ИЦХ-исследование – это комбинация цитологического и иммуноферментного методов, оно выявляет патологический процесс непосредственно в исследуемой клетке, а также определяет параметры агрессивности ВПЧ. Диагностическим критерием патологического процесса является определение наличия онкобелков p16ink4a и Ki-67, концентрация которых повышается в ответ на действие вируса (на количество вирусной нагрузки).

Кольпоскопию проводили по общепринятой методике на аппарате OLYMPUS OCS-500. Кольпоскопическую картину интерпретировали по Международной классификации кольпоскопических терминов Рио-де-Жанейро (2011 г.). Расширенная кольпоскопия позволяет выявить аномальные кольпоскопические картины (грубый ацетобелый эпителий, мозаику, пунктацию, резко контрастную йоднегативную зону, открытые железы с ороговением, атипичные сосуды и т.д.).

Рассчитывали относительные показатели (Р) и их ошибки (m), оценивали межгрупповые и внутригрупповые различия. Расчет производили с помощью пакета прикладных программ MS Office 2017 и STATISTICA 10.0. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Верификация диагноза у пациенток групп обследования состояла из трех этапов. На 1-м этапе на основании данных клинического исследования, результатов микроскопии влагалищных мазков, бактериологического метода и данных ПЦР пациенткам после постановки первоначального диагноза цервицита, бактериального вагиноза назначали антимикробную терапию с учетом этиологии микробных возбудителей и их чувствительности к препаратам и проводили контроль эффективности лечения (через 4–6 нед). Во 2-й этап входили цитологическое исследование, ИЦХ- исследование, определение типов ВПЧ, расширенная кольпоскопия. На 3-м этапе проводили прицельную и петлевую биопсию шейки матки с последующим гистологическим исследованием удаленного материала и окончательно верифицировали диагноз.

Результаты

На момент обращения к гинекологу 33 (84,62±5,78%) женщины из 1-й группы и 34 женщины (87,18±5,35%) из 2-й предъявляли жалобы на зуд, жжение в области наружных половых органов и чувство дискомфорта во влагалище. Выделения из половых путей беспокоили 37 (94,87±3,53%) пациенток и 34 (87,18±5,35%) пациентки 1 и 2-й групп соответственно (р>0,05). При микроскопическом исследовании у 34 (87,18±5,35%) пациенток 1-й группы и у 37 (94,87±3,53%) пациенток 2-й группы выявлено повышенное количество лейкоцитов в цервикальном канале (30–50 в поле зрения).

ИППП были выявлены у 16 (41,03±7,88%) женщин из 1-й группы и у 19 (48,72±8,00%) – из 2-й. В титрах, превышающих референсные значения, были обнаружены Ureaplasma urealyticum у 14 (35,9±7,68%) и у 16 (41,03±7,88%); Mycoplasma hominis – у 7 (17,95±6,24%) и у 5 (12,82±5,35%); Chlamydia trachomatis – у 8 (20,51±6,47%) и у 9 (23,08±6,75%); Trichomonas vaginalis – у 3 (7,69±4,27%) и у 2 (5,13±3,53%) пациенток 1 и 2-й групп соответственно. У 9 (23,08±6,75%) обследуемых женщин из 1-й группы и у 10 (25,64±6,99%) из 2-й была обнаружена цитомегаловирусная инфекция. Ассоциации микроорганизмов имели место у 16 (41,03±7,88%) и у 19 (48,72±8,00%) женщин 1 и 2-й групп соответственно. Бактериальный вагиноз был у 34 (87,18±5,35%) пациенток из 1-й группы и у 29 (74,36±6,99%) – из 2-й.

После антимикробной терапии на 1-м этапе наблюдения и после того, как были получены результаты, свидетельствовавшие об отсутствии воспалительного процесса, обследование пациенток продолжили на 2-м этапе наблюдения. Данные цитологического исследования показали у всех 78 (100,0%) пациенток H-SIL.

Частота встречаемости типов ВПЧ представлена в табл. 1. Статистически значимого различия между данными в группах получено не было. Лидирующие позиции занимали ВПЧ 16-го типа и ассоциации нескольких типов ВПЧ.

 

Таблица 1. Частота встречаемости типов ВПЧ у пациенток группы наблюдения

Table 1. Prevalence of human papillomavirus (HPV) types in patients of follow up group

Типы ВПЧ	1-я группа Р±m (%)	2-я группа Р±m (%)	p
16	16 (41,03±7,88)	19 (48,72±8,00)	0,506
33	6 (15,38±5,78)	6 (15,38±5,78)	–
18	4 (10,26±4,86)	5 (12,82±5,35)	0,740
44	4 (10,26±4,86)	4 (10,26±4,86)	–
31	3 (7,69±4,27)	3 (7,69±4,27)	–
Ассоциации нескольких типов ВПЧ (16, 31, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68)	10 (25,64±6,99)	12 (30,77±7,39)	0,626

 

Дисперсионный анализ также не показал наличия межгрупповой зависимости степени дисплазии от типов ВПЧ (р=0,276), в 1 и 2-й группах преобладал ВПЧ 16-го типа.

В табл. 2 представлены результаты цитологического, кольпоскопического и ИЦХ-исследований (определения экспрессии белков р16ink4a и Ki-67) у пациенток 1 и 2-й групп в зависимости от вирусной нагрузки ВПЧ.

Вирусная нагрузка у пациенток 1-й группы соответствовала параметру 3–5 Lg. При данном показателе у всех пациенток выявлялась аномальная кольпоскопическая картина, а коэкспрессия онкобелка р16ink4a и маркера пролиферативной активности Ki-67 в клетках плоского эпителия – у 25 (64,10±7,68%) женщин (табл. 2).

 

Таблица 2. Результаты цитологического, кольпоскопического исследований и экспрессии белков р16ink4a и Ki-67 у пациенток 1 и 2-й групп в зависимости от вирусной нагрузки ВПЧ

Table 2. Results of cytological and colposcopic examination and p16ink4a and Ki-67 proteins expression in patients of groups 1 and 2 depending on HPV viral load

Вирусная нагрузка ВПЧ высокого онкориска	1-я группа (n=39) Р±m (%)			2-я группа (n=39) Р±m (%)
	H-SIL	Аномальная кольпоскопическая картина 2-й степени	Экспрессия белков р16ink4a и Ki-67	H-SIL	Аномальная кольпоскопическая картина 2-й степени	Экспрессия белков р16ink4a и Ki-67
Lg от 3 до 5	39 (100–9,30)	39 (100–9,30)	25 (64,10±7,68)	0 (0+9,30)	0 (0+9,30)	0 (0+9,30)
Lg >5	0 (0+9,30)	0 (0+9,30)	0 (0+9,30)	39 (100–9,30)	39 (100–9,30)	39 (100–9,30)

 

У всех пациенток 2-й группы вирусная нагрузка соответствовала показателю >5 Lg. Аномальная кольпоскопическая картина и коэкспрессия онкобелка р16ink4a и маркера пролиферативной активности Ki-67 в клетках плоского эпителия выявлялись у всех пациенток (табл. 2).

Результаты гистологического исследования биопсий шейки матки на 3-м этапе обследования подтвердили наличие H-SIL у пациенток обеих групп. В качестве фоновой патологии у всех пациенток был хронический цервицит с койлоцитарной трансформацией.

Поскольку возраст пациенток 1-й группы превышал порог 25 лет, дальнейшая тактика их ведения заключалась в эксцизии шейки матки с последующим цитологическим исследованием, ВПЧ-тестированием и при необходимости кольпоскопическим контролем 1 раз в 6 мес в течение 2 лет. Обязательным компонентом наблюдения было проведение этиотропной коррекции обострения хронического цервицита.

Тактика ведения пациенток 2-й группы включала петлевую электроконизацию шейки матки с последующим выскабливанием оставшейся части цервикального канала с патогистологическим исследованием (в гистологическом отчете: в краях резекции наличие или отсутствие интраэпителиального поражения и глубина удаления пораженного участка не менее 6 мм), а также цитологическим, кольпоскопическим исследованиями и контрольным ВПЧ-тестированием через 2–4 мес. По результатам повторного контроля 19 (48,72±8,00%) пациенткам старше 40 лет, имевшим аномальную кольпоскопическую картину 2-й степени и позитивный анализ на ВПЧ с сохранением вирусной нагрузки, при их добровольном согласии выполнили гистерэктомию. У этих пациенток гистологический результат свидетельствовал о наличии очагов cancer in situ colli uteri в удаленных материалах. У 2 пациенток в цервикальном канале были определены единичные очаги плоскоклеточного неороговевающего рака, выраженный лейкоцитарный цервицит.

Обсуждение

Клиническая картина и исход ВПЧ-инфицирования зависят не только от типа вируса, но и от формы интеркуррентных инфекций. Большинство случаев инфицирования (80–90%) заканчивается спонтанной элиминацией ВПЧ, в то время как длительное персистирование ВПЧ на фоне хронического цервицита приводит к злокачественной трансформации клеток эпителия шейки матки [7, 8].

Белок p16ink4a относится к ингибиторам циклинзависимых киназ, которые тормозят пролиферацию; Ki-67 является белком клеточной пролиферации и экспрессируется в течение всех активных фаз клеточного цикла, отсутствуя в клетках, находящихся в фазе G0. Одновременная совместная экспрессия р16ink4a и маркера Ki-67 в одной и той же клетке указывает на нарушение регуляции клеточного цикла, связанное с ВПЧ-трансформацией и развитием дисплазии клеток эпителия шейки матки [9], и является дополнительным диагностическим инструментом, который позволяет объективизировать выявление дисплазии не только тяжелой, но и умеренной степени. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью в сравнении с рутинным цитологическим скринингом [10, 11].

Заключение

У больных с Н-SIL обязательной фоновой патологией является хронический цервицит, ассоциированный с ВПЧ. Вне зависимости от степени выраженности CIN (II или III) среди типов ВПЧ в исследовании преобладали ВПЧ 16-го типа и ассоциации разных типов ВПЧ высокого онкологического риска (41,03 и 25,64% соответственно). Полученные данные свидетельствуют о необходимости более широкого использования ИЦХ-исследования для определения маркеров р16ink4a и Ki-67 при первичном скрининге, что позволит усовершенствовать тактику ведения больных с цервикальным предраком. Персистирующее течение ВПЧ у больных с CIN II при наличии признаков коэкспрессии p16ink4a и Ki-67 диктует целесообразность петлевой эксцизии шейки матки, последующую оценку краев резекции и контроль через 6 мес согласно клиническим рекомендациям (2020 г.).

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Т.Ю. Пестрикова – концепция и дизайн исследования, написание текста; А.Ф. Исмайлова – сбор и обработка материала.

Authors’ contribution. TYu Pestrikova – concept and design of the study, writing the text; AF Ismailova – collection and processing of material.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The author declares that there is no external funding for the exploration and analysis work.

About the authors

Tatyana Yu. Pestrikova

The Far Eastern State Medical University

Email: typ50@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0219-3400

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Khabarovsk

Ainur F. Ismaylova

The Far Eastern State Medical University

Author for correspondence.
Email: dr.aynur@mail.ru

Graduate Student

Russian Federation, Khabarovsk

References