Expression of pituitary gonadotropic hormone and sex hormones receptors in endometrial cellular components during menstrual cycle

Full Text

Введение

Эндометрий представляет собой уникальную, динамически изменяющуюся ткань, основная функция которой заключается в создании оптимальных условий для имплантации эмбриона, обеспечении его роста и развития до формирования плаценты [1]. Известно, что нидация плодного яйца – это сложный процесс взаимодействия эмбриона со слизистой оболочкой тела матки, происходящий исключительно в течение средней стадии секреции и подразумевающий способность эндометрия к децидуальной трансформации, необходимой для имплантации бластоцисты [1]. Контроль за данным процессом осуществляется посредством прогестерона и эстрадиола, действующими через их родственные рецепторы эстрогена (ER) и рецепторы прогестерона (PR). Нарушение экспрессии ER и PR ведет к развитию различных репродуктивных нарушений: невозможности имплантации, что приводит к бесплодию, а также недостаточной или аномальной имплантации, приводящим к самопроизвольному прерыванию беременности или развитию преэклампсии [1–3].

Проведенные в последнее время научные работы показали присутствие в эндометрии иммунореактивности рецепторов фолликулостимулирующего (FSHR) и лютеинизирующего (LHR) гормонов [4, 5], хотя ранее полагали, что экспрессия FSHR присуща лишь клеткам гранулезы яичника [6], а иммунореактивность LGНR – только тека-клеткам и лютеиновым клеткам яичника [7]. Кроме того, доказана активность FSHR и LHR в слизистой оболочке тела матки, поскольку их стимуляция способствовала внутриклеточному накоплению циклического аденозинмонофосфата и усилению регуляции по крайней мере двух генов, стимулирующих стероидогенез [8]. Вероятно, FSHR, LHR, ER и PR оказывают сочетанное влияние на функционирование эндометрия. Однако работ, касающихся комплексного исследования иммунореактивности всех перечисленных маркеров в эндометрии, проведено крайне мало.

Цель работы – изучение экспрессии ER, PR, FSHR и LHR в образцах эндометрия женщин в разные периоды менструального цикла.

Материалы и методы

Материалом для настоящего исследования послужили образцы эндометрия 7 женщин, обратившихся в ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» для проведения вспомогательных репродуктивных методов в связи с мужским бесплодием. Препараты эндометрия получены при раздельном диагностическом выскабливании матки или аспирации биоптата в процессе обследования пациенток. У всех женщин отмечен регулярный менструальный цикл; гормональные препараты в течение 3 мес, предшествующих манипуляции, ни одна из женщин, вошедших в исследование, не получала. Возраст пациенток составил 25–45 лет. Гистологическое исследование проводилось традиционным способом, препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивались тремя разными патоморфологами. В исследование включены образцы слизистой оболочки тела матки, соответствующие фазе пролиферации (ранней, средней и поздней), а также фазе секреции (ранней, средней и поздней) и предменструального эндометрия.

Для иммуногистохимического исследования гистологические срезы, приготовленные из парафиновых блоков, предварительно депарафинизировали и регидратировали в серии ксилола и этанола соответственно. Восстановление антигена проводили с использованием специального буфера (25 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,05% SDS) при температуре 95°С в течение 40 мин. С целью блокировки неспецифического связывания гистологические срезы в течение 30 мин при комнатной температуре обрабатывали фосфатным буфером, содержащим 10% раствор сыворотки крови козы. Первичные антитела наносились вместе с блокирующим буфером на ночь при температуре 4°С. Далее на срезы добавляли соответствующие флуоресцентно-меченные вторичные антитела (табл. 1). Для изучения экспрессии CD68 проводили дополнительную амплификацию сигнала с помощью Tyramide SuperBoost™ Kit по протоколу производителя. При исследовании HABP-biotin окраску выявляли с использованием флуоресцентно-меченного стрептавидина в сочетании с вторичными антителами. Срезы докрашивались ядерным красителем HCS Nuclear Blue (Thermo Fisher 1:2000). После промывания в растворе PBS-0,2% Triton-X 100 и дистиллированной воде срезы заключали в гипертонический раствор фруктозы.

 

Таблица 1. Список антител и белков, использованных для иммуногистохимии Table 1. List of antibodies and proteins used for IHC
Мишень	Хост	Каталожный номер	Разведение
Anti-ER	Rabbit	MA5-14501, Invitrogen	1:200
Anti-PR	Rabbit	MA5-14505, Invitrogen	1:200
Anti-FSHR	Rabbit	PA5-77397, Invitrogen	1:100
Anti-LHR	Rabbit	PA5-21271, Invitrogen	1:100
Anti-CK19	Mouse	BA17, eBioscience	1:300
Anti-aSMA	Mouse	MA5-11547, Invitrogen	1:500
Anti-vWF	Rabbit	A0082, Dako	1:500
Anti-CD68	Mouse	MA5-13324, Invitrogen	1:100
HABP-biotin	–	385911, Sigma Aldrich	1:100
Aanti-mouse AlexaFluor 488	Goat	A32723, Invitrogen	1:1000
Anti-rabbit AlexaFluor 594	Goat	A32740, Invitrogen	1:1000
Tiramide SuperBoost kit	Goat anti-mouse	B40912, Invitrogen	Согласно протоколу производителя
Streptavidin Alexa Fluor 647	–	S21374, Invitrogen	1:500
HCS Nuclear Blue	–	H10325, Invitrogen	1:2000

 

Флуоресцентная микроскопия

Готовые препараты анализировали с применением флуоресцентного широкопольного микроскопа Leica DMI6000, оснащенного диодными источниками освещения (385, 470, 530, 590 и 620 нм) и набором соответствующих им светофильтров. В каждом препарате с использованием ахроматического объектива с 20-кратным увеличением (×20, объектив для микроскопа Leica HI PLAN 20×) фотографировали минимум 20 полей зрения. Полученные изображения изучали с помощью программного пакета LAS X и Fiji.

Уровень экспрессии изученных маркеров оценивали по двум критериям: число позитивных клеток по отношению к общему числу клеток, составляющих анализируемую структуру (эпителий, строма, a-SMA-позитивные клетки), и интенсивность их окрашивания, подразделяющуюся на низкую, среднюю и высокую. Уровень иммунореактивности всех рецепторов выражали в Q-score согласно алгоритму [9], приведенному в табл. 2.

 

Таблица 2. Алгоритм оценки экспрессии исследуемых рецепторов Table 2. Studied receptors’ expression evaluation algorithm
Доля позитивно окрашенных клеток, % (PS) × интенсивность окрашивания (IS) = Q-score (0–12)
Доля позитивно окрашенных клеток, % (PS)	Интенсивность окрашивания (IS), баллы	Уровень экспрессии (Q-score)
0% – 0 баллов 1–10% – 1 балл 11–50% – 2 балла 51–80% – 3 балла >80% – 4 балла	Нет окрашивания – 0 Слабая – 1 Умеренная – 2 Выраженная– 3	Негативный – 0–1 Низкий – 2–3 Умеренный – 4–8 Высокий – 9–12

 

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы GraphPad Prism 8. Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. Сравнение исследуемых групп выполнялось с помощью критерия Краскела–Уоллиса, апостериорные сравнения – с помощью критерия Данна с поправкой Холма. Статистически значимым считали значение р<0,05.

Результаты

Экспрессия ER

Экспрессия ER в эпителиоцитах эндометрия оказалась наименьшей в стадию ранней пролиферации и наибольшей – в стадию поздней пролиферации, постепенно снижаясь к концу менструального цикла (рис. 1, a). Экспрессия ER в фибробластах была наименьшая в стадию поздней секреции и предменструальной слизистой, достигнув пика в стадию поздней пролиферации. Экспрессия ER в миофибробластах и эндотелиоцитах отмечалась лишь на стадии поздней пролиферации (рис. 1, b, c). Во всех изучаемых популяциях клеток выявлена статистическая значимость различий, полученных в отношении экспрессии ER на разных стадиях менструального цикла (p<0,05). Экспрессия ER в ядрах макрофагов не определялась ни на одной из стадий менструального цикла, однако в некоторых случаях экспрессия ER выявлена в цитоплазме отдельных макрофагов (рис. 2, a).

 

Рис. 1. Характеристика экспрессии ER (a–c) и PR (d–f) в различных типах клеток эндометрия.

 

Рис. 2: a – экспрессия ER в цитоплазме отдельных макрофагов (масштабный отрезок – 15 um); b – экспрессия FSHR в макрофагах; c – экспрессия LHR в миофибробластах (масштабный отрезок – 50 um).

 

Экспрессия PR

Экспрессия рецептора прогестерона PR в эпителиоцитах эндометрия оказалась наименьшей в предменструальной слизистой, достигая максимума в стадию поздней пролиферации (рис. 1, d). Экспрессия PR в фибробластах являлась наименьшей в стадию ранней секреции и наибольшей – в стадии поздней пролиферации. Экспрессия PR в миофибробластах отмечалась на стадии средней и поздней пролиферации и средней секреции, причем максимальных значений данный показатель достигал на стадии поздней пролиферации (рис. 1, e, f). Во всех изучаемых популяциях клеток выявлена статистическая значимость различий, полученных в отношении экспрессии PR на разных стадиях менструального цикла (p<0,05). Слабая экспрессия PR наблюдалась в менее 30% макрофагов на стадии средней пролиферации, стадии ранней секреции и в предменструальном эндометрии, при этом окрашивание локализовалось в цитоплазме клеток.

Экспрессия FSHR

При исследовании эпителиального и стромального компонента эндометрия обнаружена экспрессия FSHR как в клетках эпителия, так и фибробластах, миофибробластах и эндотелиоцитах в пролиферативную и секреторную фазы менструального цикла (рис. 3, a–c). Наиболее выраженная экспрессия во всех исследуемых типах клеток отмечалась в позднюю стадию фазы пролиферации.

 

Рис. 3. Характеристика экспрессии FSHR (a–c) и LHR (d–f) в разных типах клеток эндометрия в различные стадии менструального цикла.

 

Экспрессия FSHR на стадии средней пролиферации, стадии поздней пролиферации и стадии средней секреции выявлена в 65, 90 и 90% макрофагов соответственно. Слабая интенсивность экспрессии FSHR в макрофагах отмечалась на стадии средней пролиферации и стадии средней секреции, умеренная интенсивность – на стадии поздней пролиферации (рис. 2, b).

Экспрессия LHR

Экспрессия LHR в эпителиоцитах эндометрия постепенно нарастала со стадии средней пролиферации к стадии ранней секреции и потом постепенно снижалась, достигая минимума в предменструальной слизистой тела матки (рис. 3, d). Экспрессия LHR в фибробластах оказалась наименьшей в стадию ранней секреции, постепенно нарастая к концу менструального цикла. В стадию пролиферации максимальная экспрессия LHR в фибробластах отмечена на стадии поздней пролиферации. Экспрессия LHR в миофибробластах и эндотелиоцитах отмечалась лишь в конце пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла (рис. 3, e, f; рис. 2, c). Во всех изучаемых популяциях клеток выявлена статистическая значимость различий, полученных в отношении экспрессии LHR на разных стадиях менструального цикла (p<0,05). Более 90% макрофагов, выявленных на стадиях средней и поздней пролиферации, а также на стадиях ранней и средней секреции отличались позитивной экспрессией LHR, преимущественно с низкой интенсивностью сигнала, на стадии поздней пролиферации этот показатель возрастал до среднего значения.

Обсуждение

Настоящая работа продемонстрировала соответствие между динамикой изменений иммунореактивности изученных рецепторов и структурными особенностями эндометрия в разные стадии менструального цикла. Выявлено, что имеют место инициация возрастания иммунореактивности ER и PR в железах на стадии ранней пролиферации и достижение ее максимального уровня на стадии поздней пролиферации, возникновение увеличения экспрессии ER и PR в строме на стадии ранней пролиферации, пик иммунореактивности ER в среднюю стадии пролиферации, максимальное значение экспрессии PR – в позднюю стадию пролиферации. Такая динамически изменяющаяся экспрессия стероидных гормонов в эндометрии является основополагающим фактором, ответственным за циклический рост эндометрия, процесс его отторжения и регенерации. Во время фолликулярной фазы менструального цикла эстроген, действуя через ER, индуцирует рост слизистой тела матки, способствует ее утолщению [10].

После овуляции наличие прогестерона ингибирует индуцированный эстрогеном рост и способствует трансформации рецептивного статуса эндометрия для имплантации бластоцисты [11].

Следует отметить, что максимальное значение экспрессии ER и PR выявлено в миофибробластах и эндотелиоцитах эндометрия в среднюю стадию секреции, что говорит о регуляции эстрогенами и прогестероном процесса ремоделирования сосудов, происходящего в этот период, о чем свидетельствуют и результаты, полученные в некоторых других исследованиях [12–14].

Важность поддержания баланса между экспрессией ER и PR изучалась и в исследованиях, направленных на изучение причин ненаступления беременности у пациенток, которым планируется применение вспомогательных репродуктивных технологий. Показано, что нарушение рецепторного статуса слизистой оболочки матки при бесплодии связано с нарушением экспрессии PR в железах эндометрия: в фазу пролиферации экспрессия этих рецепторов ниже, чем у фертильных женщин; в фазу секреции – выше [15, 16].

Результаты последних исследований демонстрируют наличие экспрессии FSHR и LHR не только в клетках гранулезы, тека-клетках и лютеиновых клетках яичника соответственно, но и в других клеточных популяциях женской репродуктивной системы. Так, по данным ряда авторов, FSHR и LHR обнаружены в различных структурно-функциональных компонентах матки [4, 5, 17]. Например, зависимая от фазы менструального цикла экспрессия описанных рецепторов выявлена как в железистом, так и в стромальном компоненте эндометрия, что согласуется с результатами нашего исследования. Полученные нами данные также согласуются с данными других авторов, продемонстрировавших положительную реакцию клеток эндотелия сосудов микроциркуляторного русла с FSHR и LHR [5, 18].

В нашей работе колебания полученных значений экспрессии FSHR и LHR в зависимости от фазы менструального цикла практически полностью совпадали с изменениями иммунореактивности ER и PR. Обнаруженное повышение иммунореактивности FSHR и LHR в железах и строме эндометрия средней и поздней стадии пролиферации может свидетельствовать в пользу их содействия в увеличении толщины функционального слоя слизистой оболочки тела матки. Необходимо также отметить, что присутствие экспрессии FSHR и LHR во всех изученных компонентах эндометрия в среднюю стадию секреции, вероятно, связано с децидуализацией стромы эндометрия и формированием благоприятных условий для развития плаценты, следующими за имплантацией бластоцисты. В пользу этого свидетельствует ряд работ, установивших, что стимуляция описанных рецепторов способствовала развитию децидуального фенотипа клеток стромы эндометрия in vitro [5, 19]. Так, A. Das и соавт. в своем исследовании показали, что в результате связывания фолликулостимулирующего гормона с его рецептором, присутствующим в эндометрии, происходит активация ароматазы, которая, в свою очередь, способствует локальной выработке эстрогенов. Последние регулируют экспрессию белков, способствующих децидуальной трансформации стромальных клеток и укреплению межщелевых контактов между ними. Кроме того, локально секретируемые эстрогены стимулируют экспрессию транскрипционного фактора HIF2a, контролирующего синтез сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, обеспечивающего ремоделирование сосудов и формирование новой кровеносной сети, необходимых для полноценного роста и развития эмбриона на ранних сроках беременности [20]. Одновременно с этим существуют научные работы, демонстрирующие развитие аденомиоза, эндометриоза и лейомиомы матки в процессе активации ароматазы и изменения локального биосинтеза эстрогенов [21–23].

В настоящее время обнаружено, что эндометриальные макрофаги принимают участие в регенерации ткани после менструации, секреторной трансформации слизистой оболочки тела матки, предшествующей имплантации, инициации менструального отторжения эндометрия и фагоцитарного клиренса остатков эндометрия после менструации [24, 25]. Результаты настоящей работы также подтверждают существенную роль макрофагов в эндометрии, поскольку иммунореактивность всех изученных рецепторов визуализировалась на протяжении менструального цикла. Кроме того, экспрессия разных маркеров наблюдалась в различные периоды менструального цикла, позволяя предположить регуляцию стероидными и гонадотропными гормонами функционирования макрофагов.

Заключение

Таким образом, настоящая работа продемонстрировала соответствие между динамикой изменений иммунореактивности изученных рецепторов и структурными особенностями эндометрия в разные стадии менструального цикла. Показано, что увеличение экспрессии ER, PR, FSHR и LHR в эндометрии женщины в среднюю и позднюю стадии пролиферации совпадает с периодом роста слизистой тела матки, повышенная иммунореактивность PR в строме на протяжении фазы секреции связана с децидуализацией эндометрия, способствующей успешной последующей имплантации, увеличенная экспрессия FSHR и LHR в железах и строме в среднюю стадию секреции ассоциирована с децидуальной трансформацией слизистой тела матки и, по- видимому, с созданием условий для полноценного развития эмбриона в случае наступления беременности.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. А.С. Магнаева – сбор и обработка материала; А.В. Трегубова – сбор и обработка материала; А.А. Цитрина – концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, написание текста; А.В. Асатурова – сбор и обработка материала, редактирование; М.В. Шамаракова – концепция и дизайн исследования, написание текста; Г.И. Табеева – редактирование; Л.С. Ежова – редактирование; Е.А. Калинина – редактирование; В.К. Боженко – редактирование.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. AS Magnaeva – сollected the data and performed the analysis; AV Tregubova – сollected the data and performed the analysis; AA Tsitrinа – сonceived the study and designed the experiment, сollected the data and performed the analysis, wrote the paper; AV Asaturova – сollected the data and performed the analysis, edited the manuscript; MV Shamarakova – сonceived the study and designed the experiment, wrote the paper; GI Tabeeva – edited the manuscript; LS Ezhova – edited the manuscript; EA Kalinina – edited the manuscript; VK Bozhenko – edited the manuscript.

Госзадание

Источник финансирования. Исследование поддержано Правительством РФ. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» (№122020900122-7) и при финансовой поддержке гранта РФФИ №16-29-07434.

Funding source. The study was supported by the Governmental. The study was carried out within the framework of State Assignment to Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology (№122020900122-7) and was supported by the Russian Foundation for Basic Research, Project №16-29-07434.

About the authors

Alina S. Magnaeva

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5223-9767

Res. Assist.

Russian Federation, Moscow

Anna V. Tregubova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4601-1330

Res. Assist.

Russian Federation, Moscow

Alexandra A. Tsitrina

Koltzov Institute of Developmental Biology

Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2827-9993

Res. Officer

Russian Federation, Moscow

Alexandra V. Asaturova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Author for correspondence.
Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8739-5209

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Marina V. Shamarakova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0972-4350

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Guzal I. Tabeeva

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1498-6520

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Larisa S. Ezhova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9804-8349

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Elena A. Kalinina

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8922-2878

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Vladimir K. Bozhenko

Russian Scientific Center of Roentgenoradiology

Email: a.asaturova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8351-8152

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files