Embryo aneuploidy and ivf outcomes in patients with different spermatozoa aneuploidy rates

Full Text

Abstract

Our goal was to study the 13, 18, 21, X, Y chromosomes aneuploidy rate in the embryos of the couples with different spermatozoa aneuploidy rate.In prospective cohort study 56 infertile couples were divided into 3 groups by the spermatozoa aneuploidy rate and preimplantation genetic diagnosis (PGD) by fluorescence in situ hybridization performance.There was a statistically significant correlation between the spermatozoa aneuploidy rate and the number of aneuploid embryos (r=0,19; p=0,0248). The most common types of chromosomal aberrations were 21 and X chromosome monosomy, and sex chromosomes polysomy. In the PGD group with spermatozoa aneuploidy level >0,7% the pregnancy rate was 50% as compared with no-PGD group with pregnancy rate of 8,6% (Kaplan–Meier; p=0,0135).Patients with high rate of spermatozoa aneuploidy are at risk of chromosomal aberrations in the embryos.

Full Text

В спомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) связаны с именем Роберта Эдвардса, которому удалось провести первое успешное экстракорпоральное опло- дотворение (ЭКО), результатом чего стало рождение первого «ребенка из пробирки». Современная медицина достигла больших успехов в этом направлении. Благодаря методу ЭКО ранее бесплодные супружеские пары получили возможность иметь детей, а появление метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) дало возможность иметь потомство мужчинам с ранее неизлечимыми формами бесплодия. Однако известно, что у мужчин с отклонениями в по- казателях спермограммы гораздо чаще, чем в популяции, встречаются количественные и структурные изменения хро- мосом [1, 2]. В нескольких исследованиях были представлены данные о том, что у мужчин с разными видами патозооспер- мии статистически значимо увеличивается риск анеуплои- дии хромосом в сперматозоидах по сравнению с группой мужчин с нормозооспермией [3, 4]. Некоторые авторы со- общили, что это увеличение частоты хромосомных анома- лий обратно пропорционально концентрации сперматозоидов [5]. В настоящее время для определения анеуплоидии хро- мосом широко используется молекулярно-цитогенетиче- ский метод – флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Ряд ученых сообщают о влиянии патозооспермии на возникно- вение анеуплоидии у полученных эмбрионов в программах ЭКО/ИКСИ [6, 7]. В некоторых исследованиях было проана- лизировано влияние анеуплоидии в сперматозоидах на кли- нические исходы циклов ЭКО/ИКСИ. Эти исследования дока- зывают, что отсутствие имплантации эмбриона и привыч- ный выкидыш непосредственно связаны с повышенным уровнем анеуплоидии в гаметах [8–10]. В настоящее время во многих клиниках ЭКО мужчин с из- менениями в FISH-анализе спермы относят к группе риска по рождению детей с генетическими отклонениями. По- этому таким супружеским парам рекомендуется проведение преимплантационной генетической диагностики (ПГД) с целью выбора эуплоидных эмбрионов и, следовательно, улучшения результатов циклов ЭКО и профилактики рожде- ния детей с генетическими отклонениями. Несмотря на по- тенциально негативное влияние генетически измененных сперматозоидов на результаты циклов ЭКО и предполагае- мые преимущества ПГД в этих случаях, нет исследований, непосредственно демонстрирующих эффект, который ока- зывают сперматозоиды с повышенной частотой хромосом- ной анеуплоидии на эмбрионы в циклах ЭКО. Целью исследования было изучение частоты анеуплои- дии хромосом 13, 18, 21, X, Y в эмбрионах супружеских пар с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах. Материалы и методы В проспективное когортное исследование были включены 56 бесплодных супружеских пар, которые нуждались в прове- дении лечения методами ЭКО/ИКСИ. Критериями включе- ния со стороны женщин были нормальный кариотип, воз- раст до 38 лет, нормальный овариальный резерв, уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) менее 12 мМЕ/мл, отсутствие противопоказаний к проведению ВРТ. Со стороны мужчин условиями включения в исследование были нормальный кариотип, качественные и/или количе- ственные изменения в спермограмме, отсутствие указаний на проведение химио- или лучевой терапии в анамнезе, отсут- ствие острых воспалительных заболеваний, обструкции се- мявыносящих путей и приема лекарственных средств со спермотоксичным действием. Критериями исключения были развитие синдрома гиперстимуляции яичников сред- ней или тяжелой степени в данном цикле ЭКО, а также другие состояния и осложнения, требующие отмены переноса эм- брионов (ПЭ) в изучаемом цикле. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Перед включением в протокол ЭКО пациенты были об- следованы согласно Приказу Минздрава России №107н от 30.08.2012 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» [11]. Мужчинам прово- дился анализ эякулята, согласно рекомендациям Всемир- ной организации здравоохранения 2010 г., 2 раза с интер- валом в 3 мес [12]. Помимо обязательного обследования па- циентам проводилось молекулярно-цитогенетическое ис- следование сперматозоидов. Количество хромосом в спер- матозоидах оценивалось с помощью FISH-метода. Прово- дилась оценка хромосом 18, X, Y. Препараты клеток эяку- лята готовили по методу M.Guttenbach (1994 г.) [13]. Гибри- дизацию in situ проводили в соответствии с протоколом, рекомендуемым фирмой-производителем [14]. Для этого использовали ДНК-зонды Vysis (Abbott Molecular, США), предварительно денатурированные и прямо меченные раз- ными флуоресцентными красителями. По числу выявлен- ных сигналов судили о количестве исследуемых хромосом. Микроскопический анализ проводили при увеличении 100×10 с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss. Для каждого пациента были оце- нены не менее 500 сперматозоидов. Стимуляция функции яичников проводилась по единому «короткому» протоколу с применением рекомбинантного ФСГ и антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона. Триггер овуляции вводился при наличии в яичниках фол- ликулов диаметром 17 мм и более. В качестве триггера ис- пользовался человеческий хорионический гонадотропин (ХГТ) в дозе 7500–10 000 МЕ. Трансвагинальная пункция (ТВП) яичников осуществлялась через 36 ч после введения ХГТ. Поддержка лютеиновой фазы индуцированного цикла у всех пациенток проводилась по стандартному протоколу с назначением натурального микронизированного проге- стерона интравагинально в дозе 600 мг в день после ТВП. На 3-и сутки развития всем пригодным для биопсии эм- брионам была проведена ПГД. Для этого производили за- бор исключительно одного бластомера от каждого иссле- дуемого эмбриона. В эмбрионах определялось количество исследуемых хромосом (13, 18, 21, X, Y) FISH-методом. Для FISH использовали зонды Vysis (Аbbott). Гибридизацию проводили для пяти хромосом в соответствии с протоко- лом, рекомендуемым фирмой-производителем [14]. Пока- занием для проведения ПГД были указания на хромосом- ные аномалии у потомства и/или множественные неудач- ные попытки ЭКО в анамнезе. Для статистического анализа использовался пакет стати- стических программ Statistica 10 (США). Расчет объема вы- борки был основан на данных литературы о частоте на- ступления беременности в программах ВРТ у пар с раз- ными параметрами спермограммы [15]. Для получения ва- лидных данных при принятии уровня альфа 0,05, уровня достоверности исследования 90% с учетом возможного 15% выбывания пациентов из исследования достаточно включения 27 пациентов в каждую группу. Первичной конечной точкой явилoсь скорректирован- ное отношение шансов (ОШкор) развития анеуплоидии и разных типов анеуплоидии в бластомерах у пар с различ- ным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах. Вторичными конечными точками были средний уровень анеуплоидии сперматозоидов у пар с наличием и отсутствием эуплоид- ных эмбрионов, корреляционная зависимость между уров- нем анеуплоидии сперматозоидов и числом анеуплоидных эмбрионов, ОШкор наступления беременности в зависимо- сти от проведения ПГД в парах с высоким и нормальным уровнем анеуплоидии сперматозоидов. Биохимическая беременность диагностировалась при повышении уровня b-ХГТ выше порогового через 2 нед после ПЭ с последующим его падением без визуализации плодного яйца при ультразвуковом исследовании (УЗИ). Клиническая беременность диагностировалась при повы- шении уровня b-ХГТ выше порогового через 2 нед после ПЭ и последующей визуализации плодного яйца при УЗИ. Статистический анализ проводился с применением c2-теста для сравнения частотных показателей, t-теста и те- ста Манна–Уитни для сравнения непрерывных показате- лей в двух группах, теста Краскела–Уоллиса в трех группах, а также многофакторного регрессионного анализа (логи- стической регрессии) для расчета ОШ исходов программ ВРТ. Корреляционный анализ проводился с использова- нием непараметрического корреляционного критерия Спирмена. Для сравнения частоты наступления беременно- сти был использован метод Кокс-регрессии с построением кривых дожития. Достоверность данных оценивалась с по- мощью теста Log-Rank. Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне достоверности p<0,05. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И.Кулакова Минздрава России. Результаты В исследование были включены 56 супружеских пар. Перед включением в программу ЭКО/ИКСИ пары были обсле- дованы согласно протоколу. В зависимости от результатов FISH-анализов сперматозоидов, а также прохождения ПГД, супружеские пары были поделены на 3 группы. Критерий повышенного уровня анеуплоидии в сперматозоидах со- ставил порог отсечки 0,7% [16]. Группу 1 (n=12) составили пациенты с уровнем анеуплоидии в сперматозоидах более 0,7% от общего числа сперматозоидов, прошедшие ПГД; группу 2 (n=21) – пациенты с уровнем анеуплоидии в сперструктура хромосомных нарушений у эмбрионов Группы моносомия, % 13 18 21 х абс. % абс. % абс. % абс. % 1 (n=52) 8 15,4 7 13,4 10 19,2 10 19,2 2 (n=81) 7 8,6 9 11,1 9 11,1 6 7,4 нуллисомия, % 13 18 21 х/y абс. % абс. % абс. % абс. % 1 (n=52) 0 0 5 9,6 3 5,7 1 1,9 2 (n=81) 1 1,2 4 4,9 3 3,7 2 2,4 Полисомия, % 13 18 21 х/y абс. % абс. % абс. % абс. % 1 (n=52) 6 11,5 5 9,6 1 1,9 4 7,7 2 (n=81) 6 7,4 8 9,8 4 4,9 13 16 матозоидах менее 0,7%, прошедшие ПГД; группу 3 (n=23) – пациенты с уровнем анеуплоидии в сперматозоидах более 0,7% от общего числа сперматозоидов, не прошедшие ПГД. Уровень анеуплоидии в сперматозоидах статистически значимо отличался в группах пациентов и был выше у па- циентов групп 1 и 3, составив 0,96±0,33% в группе 1, 0,35±0,18% в группе 2 и 1,41±0,78% в группе 3 (p<0,0001). Средний возраст включенных в исследование женщин составил 33,0±5,4, 31,1±5,1 и 32,3±4,1 года (р=0,7350), возраст мужчин – 40,2±10,4, 37,3±6,2, 34,8±6,2 года (р=0,1494) в группах 1, 2 и 3 соответственно. При анализе клинико-анамнести- ческих данных, как возможных конфаундеров, группы не от- личались статистически значимо по соматической и гинеко- логической заболеваемости, менструальной функции и аку- шерскому анамнезу. Исключение – заболеваемость пациен- ток хроническим сальпингоофоритом, которая была выше в группах 2 и 3 (42,8 и 47,8%) по сравнению с группой 1 (0%; р=0,0135). Также в группе 2 отмечались более частые заболе- вания верхних дыхательных и мочевыводящих путей рис. 1. Коробочный график, отражающий уровень анеуплоидии в ядрах сперматозоидов в группах пар с анеуплоидными (группа 1) и эуплоидными эмбрионами (группа 2); в пересчете на эм- брионы. Средний уровень анеуплоидии статистически значимо выше в группе с анеуплоидными эмбрионами по сравнению с группой без хромосомных нарушений эмбрионов (р=0,0368). Box & Whisker Plot 0,80 Уровень анеуплоидии ядер сперматозоидов (FISH) 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 1 0 (23,8/19% по сравнению с 0/0 и 4,3/0% в группах 1 и 3 соот- ветственно). Длительность бесплодия была самая большая в 3-й группе пациентов и составила в трех группах 3,5±2,3, 3,5±1,8 и 5,7±3,5 года соответственно (р=0,0490). Для оценки влияния уровня анеуплоидии хромосом в спер- Группы пациентов: 1 – эмбрионы с разными анеуплоидиями 0 – эуплоидные эмбрионы Mean Mean±SE Mean±1,96*SE матозоидах на риск получения анеуплоидных эмбрионов мы провели сравнение групп пациентов, прошедших ПГД (группы 1 и 2). Всего в этих группах было получено 198 эм- брионов (80 в группе 1 и 118 в группе 2). Эмбрионов класса D было 9 и 14, остановились в развитии 17 и 21 эмбрион из групп 1 и 2 соответственно. Четыре эмбриона имели разную патологию в виде отсутствия ядер, наличия двух или более рис. 2. Кривые Каплана–майера, отражающие случаи наступления беременности в группах пациентов с повышенным уровнем анеуплоидии ядер сперматозоидов, прошедшие и не прошедшие ПГд. Частота наступления беременности была значимо выше в группе пациентов, прошедших ПГД (группа 1; р=0,0135). Cumulative Proportion Surviving (Kaplan–Meier) Complete Censored ядер, а также артефакты, мешающие проведению FISH. Остав- шиеся 133 эмбриона (52 в группе 1 и 81 в группе 2) были под- вергнуты ПГД. В группе пациентов с высоким уровнем анеу- плоидии в сперматозоидах было получено 32 (61,5%) анеу- плоидных эмбриона по сравнению с группой пациентов с низким уровнем анеуплоидии в сперматозоидах – 33 из 81 (40,7%; р=0,0192). При проведении регрессионного анализа с учетом выявленных конфаундеров (заболеваемости пациен- ток) ОШкор составило 2,33, 95% доверительный интервал 1,13–4,78. Наиболее частыми типами хромосомной патоло- гии были моносомия хромосом 21 и Х, а также полисомия половых хромосом. Структура хромосомных нарушений не отличалась значимо в 2 группах пациентов (см. таблицу). Средний уровень анеуплоидии в сперматозоидах в груп- пах анеуплоидных и эуплоидных эмбрионов составил 0,67±0,36 и 0,55±0,33% соответственно (р=0,0368); рис. 1. 1,0 Cumulative Proportion Surviving 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Дни от 1-го дня последней менструации до УЗИ Группа 1 Группа 3 Наблюдалась статистически значимая корреляционная связь между уровнем анеуплоидии сперматозоидов и чис- лом анеуплоидных эмбрионов (r=0,19; р=0,0248). Вследствие проведения ПГД в группе 1 и отбора эмбрио- нов с нормальным хромосомным набором для переноса в полость матки исходы ЭКО/ИКСИ были сопоставимы в сравниваемых группах пациентов. Клиническая беременность была диагностирована в 6 из 12 случаев в группе 1 (50%) и в 6 из 21 случая в группе 2 (28,6%; р=0,2183). Для оценки влияния уровня анеуплоидии сперматозоидов на исходы ЭКО/ИКСИ мы провели сравнение групп пациен- тов с повышенным уровнем анеуплоидии хромосом в спер- матозоидах, прошедших и не прошедших ПГД (группы 1 и 3). В группе 1 было диагностировано 8 биохимических беременностей (66,6%) по сравнению с группой 3, в которой био- химические беременности наступили в 5 случаях (21,7%; р=0,009). Частота клинических беременностей составила при этом 50% (6 из 12) в группе 1 и 8,6% (2 из 23) в группе 3 (р=0,0057). Частота наступления беременности была оценена в модели Кокс пропорциональной регрессии с построением кривых дожития. Время наблюдения являлось цензурирован- ным временем (дни наблюдения = дата УЗИ - дата последней менструации), время наступления положительного исхода явилось «временем до события». Мы оценили распределение «времени до события» и частоты наступления беременности с помощью метода Каплана–Майера. Была выявлена значи- мая разница в частоте наступления беременности в группах сравнения (р=0,0135); рис. 2. Обсуждение Хромосомные аномалии в кариотипе или в половых клетках могут являться одной из причин бесплодия чело- века. У пациентов с изменениями в спермограмме в ре- зультате неправильной мейотической рекомбинации мо- жет образоваться большое число сперматозоидов с анеу- плоидией. В данном исследовании мы изучили группу бесплодных пар с нормальным кариотипом, измене- ниями в спермограмме и FISH-анализе у мужчин, которым проводился цикл ЭКО/ИКСИ. Чтобы минимизировать влияние женского фактора на результаты программ ВРТ, нами были отобраны супружеские пары с трубно-перито- неальным и/или мужским фактором бесплодия. Средний возраст женщин в группах составил 33,0±5,4, 31,1±5,1 и 32,3±4,1 года. Некоторые исследования показали, что в ко- горте женщин после 40 лет частота наступления беремен- ности значительно снижается и повышается риск хромо- сомной анеуплоидии в половых клетках по сравнению с женщинами моложе 40 лет [17, 18]. Для исключения влия- ния женского фактора в исследовании мы включили жен- щин до 38 лет. При проведении FISH-анализа сперматозоидов наибо- лее частыми хромосомными нарушениями, выявленными у пациентов, были диплоидия (у 51% пациентов) и дисо- мия половых хромосом (у 36% пациентов). Мы разделили пациентов на группы в зависимости от уровня анеуплои- дии сперматозоидов, который в ходе проведенного нами в прошлых исследованиях многофакторного анализа с по- строением ROC-модели составил 0,7% [16]. Наши резуль- таты согласуются с результатами, описанными в литера- туре [19–21]. Главной целью нашего исследования была оценка ча- стоты анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X, Y в эмбрионах. В результате частота анеуплоидии в эмбрионах была выше в группе 1, чем в группе 2, и составила 61,5 и 40,7% соответ- ственно (р=0,0192). Шансы возникновения хромосомной анеуплоидии в эмбрионах в группе пациентов с измене- ниями FISH-анализа были в 2,3 раза выше, чем в группе сравнения. Схожие данные были получены в исследовании M.Sánchez-Castro и соавт. [20]. Частота наступления бере- менности статистически значимо не отличалась в двух группах. Мы связываем это с тем, что в группе с высоким уровнем анеуплоидии сперматозоидов осуществлялся ПЭ без анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X, Y. При дополнительном анализе бесплодных супружеских пар с высоким уровнем анеуплоидии в сперматозоидах, ко- торым проводилась (группа 1) и не проводилась ПГД (группа 3), мы выявили, что частота наступления беремен- ности в группе 1 составила 50% по сравнению с группой 3, в которой забеременели лишь 8,6% женщин. Частота наступ- ления беременности, оцененная с помощью метода Ка- плана–Майера, была значимо выше в группе пациентов, прошедших ПГД (р=0,0135). Выводы Таким образом, пациенты с изменениями в спермограмме и повышенным уровнем анеуплоидии в спермато- зоидах представляют группу риска по выявлению разных анеуплоидий у эмбрионов в программах ВРТ. Поэтому данной категории пациентов необходимо рекомендовать до- полнительное генетическое консультирование с целью ре- шения вопроса о возможности проведения молекулярно- цитогенетического анализа эмбрионов. ПГД является мето- дом ранней и надежной профилактики врожденной и на- следственной патологии плода, позволяя осуществить се- лекцию генетически полноценных эмбрионов. В клиниче- ской практике ВРТ использование ПГД приводит к увеличе- нию частоты наступления беременности и снижению риска рождения детей с генетической патологией.
×

References

  1. Martin R.H, Rademaker A.W, Greene C et al. A comparison of the frequency of sperm chromosome abnormalities in men with mild, moderate, and severe oligozoospermia. Biol Reprod 2003; 69: 535–9.
  2. Hofherr S.E, Wiktor A.E, Kipp B.R et al. Clinical diagnostic testing for the cytogenetic and molecularcauses of male infertility: the Mayo Clinic experience. JARG 2011; 28 (11): 1091–8.
  3. Mehdi M, Gmidene A, Brahem S et al. Aneuploidy rate in spermatozoa of selected men with severe teratozoospermia. Andrologia 2012; 44 (Suppl. 1): 139–43.
  4. Collodel G, Capitani S, Baccetti A et al. Sperm aneuploidies and low progressive motility. Hum Reprod 2007; 22 (7): 1893–8.
  5. Vegetti W, van Assche E, Frias A et al. Correlation between semen parameters and sperm aneuploidy rates investigated by fluorescence in - situ hybridization in infertile men. Hum Reprod 2000; 15: 351–65.
  6. Magli M.C, Gianaroli L, Ferraretti A.P et al. Paternal contribution to aneuploidy in preimplantation embryos. Reprod Biomed Online 2009; 18 (4): 536–42.
  7. Dubey А, Dayal M.B, Frankfurter D et al. The influence of sperm morphology on preimplantation genetic diagnosis cycles outcome. Fertil Steril 2008; 89 (6): 1665–9.
  8. Burrello N, Vicari E, Shin P et al. Lower sperm aneuploidy frequency is associated with high pregnancy rates in ICSI programmes. Hum Reprod 2003; 18: 1371–6.
  9. Nicopoullos J.D.M, Gilling-Smith C, Almeida P.A et al. The role of sperm aneuploidy as a predictor of the success of intracytoplasmic sperm injection? Hum Reprod 2008; 23: 240–50.
  10. Rubio C, Gil-Salom M, Simon C et al. Incidence of sperm chromosomal abnormalities in a risk population: relationship with sperm quality and ICSI outcome. Hum Reprod 2001; 16: 2084–92.
  11. Приказ Минздрава России №107н от 30.08.2012 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» https://www.ros- minzdrav.ru/docs/mzsr/orders/1363
  12. Cooper T.G, Noonan E, von Eckardstein S et al. World Health Organization reference values for human semen characteristics. Hum Reprod Update 2010; 16 (3): 231–45.
  13. Guttenbach M, Schakowski R, Schmid M. Incidence of chromosome 3, 7, 10, 11, 17 and X disomy in mature human sperm nuclei as determinant by nonradioactive in situ hybridization. Hum Genet 1994; 93 (1): 7–12.
  14. FISH chromosome search technology by Abbott Molecular http://www.abbottmolecular.com/us/technologies/fish/vysis-chromosome-search.html
  15. Akl L.D, Oliveira J.B, Petersen C.G et al. Efficacy of the motile sperm organelle morphology examination (MSOME) in predicting pregnancy after intrauterine insemination. Reprod Biol Endocrinol 2011; 9: 120.
  16. Долгушина Н.В., Сокур С.А., Глинкина Ж.И., Калинина Е.А. Исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у супружеских пар с различными видами патозооспермии у мужчин. Акушерство и гинекология. 2013; 10: 69–75.
  17. Yan J, Wu K, Tang R et al. Effect of maternal age on the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET). Sci China Life Sci 2012; 55 (8): 694–8.
  18. Reproductive Endocrinology and Infertility Committee; Family Physicians Advisory Committee; Maternal-Fetal Medicine Committee; Executive and Council of the Society of Obstetricians, Liu K, Case A. Advanced reproductive age and fertility. J Obstet Gynaecol Can 2011; 33 (11): 1165–75.
  19. Gianaroli L, Magli M.C, Ferraretti A.P. Sperm and blastomere aneuploidy detection in reproductive genetics and medicine. J Histochem Cytochem 2005; 53 (3): 261–7.
  20. Sánchez-Castro M, Jim Оnez-Macedo A.R, Sandalinas M, Blanco J. Prognostic value of sperm fluorescence in situ hybridization analysis over PGD. Hum Reprod 2009; 24 (6): 1516–21.
  21. Durak Aras B, Aras I, Can C et al. Exploring the relationship between the severity of oligozoospermia and the frequencies of sperm chromosome aneuploidies. Andrologia 2012; 44 (6): 416–22.

Statistics

Views

Abstract: 224

Article Metrics

Metrics Loading ...

Refbacks

  • There are currently no refbacks.


Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies