Physical aspects of photodinamic therapy application to chronic vulvovaginal candidiasis

Full Text

Ф отодинамическая терапия (ФДТ) в качестве метода лечения широко применяется в клинической практике на протяжении последних 25 лет. Однако основы ФДТ были известны еще несколько тысячеле- тий тому назад. В Древнем Египте и Индии для лечения ви- тилиго и псориаза использовались природные фотосенси- билизаторы (ФС), которые содержались в китайском тмине, зверобое, петрушке, пастернаке и некоторых зер- новых культурах. Впоследствии выяснилось, что в этих ра- стениях содержатся природные ФС - псоралены. При дальнейшем изучении свойств ФС выявлено, что при воз- действии света определенной длины волны, соответствую- щей пику поглощения ФС, в результате абсорбции фотоны из своего основного состояния переходят в более высокое энергетическое состояние. Из этого возбужденного состояния электроны ФС переносят свою энергию на кисло- род, образуя высокоактивные формы кислорода, как, на- пример, крайне цитотоксический продукт - синглентный кислород. Вместе с ним могут образоваться и другие актив- ные формы кислорода, такие как супероксид и гидрокси- радикалы, которые также имеют существенный цитоток- сический эффект. Следует отметить, что ФС без воздей- ствия световой энергии не вызывает никакого токсиче- ского эффекта на органы и ткани и каждому значению длины волны соответствует определенная глубина про- никновения ФС в ткани. На молекулярном уровне в биологических системах це- лью цитотоксических реакций являются аминокислоты, липиды и нуклеиновые кислоты. Такие аминокислоты, как метионин, гистидин, триптофан, тирозин и цистеин сильно повреждаются как в свободном состоянии, так и в составе пептидов и белков [1-4]. Если данные аминокис- лоты находятся в активных центрах белков, то конформа- ционные изменения могут приводить к их инактивации [5-8]. Что касается нуклеиновых кислот, то наиболее чув- ствительным к ФДТ является гуанин [9-12]. В ДНК это приводит к точечным мутациям, делециям, а также обрывам в молекуле [13-15]. Фотоокисление ненасы- щенных жирных кислот, к примеру, в мембранах вызывает их нестабильность и разрушение [16, 17]. Это может приве- сти, например, к нарушениям проницаемости сосудов и стазу крови в них, к ишемии в области неопластически из- мененных тканей, а позднее - к развитию в них селектив- ного некроза [18, 19]. ФС в современной медицине приме- няются не только для лечения, но и для безопасной диагно- стики. В России ФДТ начала применяться с 1992 г. Первона- чально данный метод использовался при лечении опухо- лей кожи и внутренних органов, а затем при лечении неко- торых доброкачественных заболеваний: трофических язв, псориаза, крауроза вульвы, патологии шейки матки, влага- лища и др. В онкологии ФДТ используется для таргентного лечения злокачественных опухолей [20]. Что касается неонкологи- ческого применения, ФДТ широко используется в офталь- мологии, дерматологии, гастроэнтерологии, ревматоло- гии, урологии. В гинекологии ФДТ с успехом используется при лечении рака яичников, эндометриоза, цервикальных интраэпителиальных неоплазий шейки матки, вульвы и влагалища, рака шейки матки и вульвы, склерозирующего лихена, остроконечных кондилом вульвы. Кроме того, отмечено антимикробное и фунгицидное действие ФДТ в культуре клеток. Данная область примене- ния ФДТ является наиболее актуальной в связи с ростом ре- зистентности микроорганизмов к разным видам антибак- териальных средств. Необходимо отметить, что в последние годы увеличива- ется число больных хроническим вульвовагинальным кан- дидозом, который регистрируется не только как самостоя- тельное заболевание, но и как сопутствующее другим ин- фекциям, передаваемым половым путем. Кандидозный вульвовагинит - одна из наиболее частых причин обращения женщин за медицинской помощью. Ча- стота его за последние 10 лет почти удвоилась и составляет 30-45% в структуре инфекционных поражений вульвы и влагалища. Внедрение современных технологий в клини- ческую микробиологию позволило расширить исследова- ния и показать, что отрицательное воздействие факторов внешней среды на микрофлору макроорганизма разной локализации, в том числе влагалища, ведет к разнообраз- ной патологии как воспалительного, так и невоспалитель- ного генеза. Несмотря на значительные успехи, достигну- тые в диагностике, терапии и профилактике дисбактерио- зов влагалища, их частота не имеет отчетливой тенденции к снижению [3-5, 10]. Последнее связано также с ростом иммунодефицитных состояний на фоне ухудшения эколо- гической обстановки, неправильного питания, частых стрессов, фармакологического бума с бесконтрольным применением лекарственных средств, в первую очередь антибиотиков и др. Чаще всего инфекция полового тракта бывает обусловлена несколькими патогенными факторами - бактериями, грибами, простейшими, виру- сами, которые вызывают похожие по клиническому тече- нию, но разные по патогенезу и методам лечения заболева- ния [1, 3, 7, 8, 11]. Селективность действия ФДТ заключается, с одной сто- роны, в локальном и прецизионном использовании лазер- ного облучения, а также в избирательном накоплении ФС в инфицированных клетках - с другой. В основе избиратель- ного накопления ФС в инфицированных тканях лежат скудный лимфоотток, повышенная васкуляризация, сниже- ние рН, наличие большого количества рецепторов к липо- протеинам низкой плотности, измененная структура стромы, повышенная активность ряда ферментов (5-ами- нолевулинатдегидратаза, порфобилиногендезаминаза, уропорфириногендекарбоксилаза и др.) [21, 22]. Рис. 1. Светодиодный осветитель АФС с длиной волны 400 нм (ООО «Полироник»). Рис. 2. Спектр поглощения и флюоресценции протопорфирина IX. Рис. 3. Установка «ЛЭСА-01-Биоспек» для флюоресцентной диагностики. В настоящее время в гинекологии наиболее перспек- тивно применение 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) в качестве ФС. В нормальных тканях она синтезируется в ми- тохондриях из сукцинил-КоА-промежуточного продукта цитратного цикла и глицина и является первым продуктом в синтезе гема. Данная реакция катализируется 5-аминоле- вулинсинтазой и определяет скорость реакции для всего процесса синтеза гема. Протопорфирин IX является промежуточным продуктом в синтезе гема (рис. 1), хелатирование его с железом приво- дит к образованию пигмента крови - гема [23, 24]. Инфицированные клетки переводят в большей или мень- шей степени экзогенно вводимую 5-АЛК во флюоресци- рующие порфирины, такие как протопорфирин IX [25, 26]. Таким образом, в лечении разных инфекционных забо- леваний, в том числе и вульвовагинального кандидоза, воз- можно выделить следующие преимущества ФДТ: Селективное накопление порфиринов, образующихся в результате эндогенного назначения (5-АЛК) в инфи- цированных тканях. Быстрая фармакокинетика даже при использовании больших дозировок 5-АЛК. Отсутствие выраженных фототоксических поврежде- ний здоровых тканей. Возможность проведения повторных курсов лечения. Цель исследования - оценка эффективности и без- опасности проведения ФДТ с 5-АЛК (препаратом Аласенс) у женщин с хроническим вульвовагинальным кандидозом. Задачи исследования Проведение спектрального мониторинга для оценки накопления АЛК-индуцированного протопорфирина IX в оптимальных количествах для проведения ФДТ. Оценка эффективности ФДТ с использованием 5-АЛК у женщин с хроническим вульвовагинальным кандидозом. Выявление возможных побочных эффектов и ослож- нений при проведении ФДТ с использованием 5-АЛК, разработка методов коррекции побочных реакций и их предупреждение. Оценка динамики изменений микрофлоры влагалища до и после сеанса ФДТ. На основании проведенных исследований определе- ние роли и места ФДТ с 5-АЛК в лечении хронических вульвовагинальных кандидозов. Материалы и методы В исследование были включены 60 пациенток: 20 с вульвовагинальным кандидозом, 25 - с бактериальным вагино- зом и 15 - с неспецифическим вагинитом. Флюоресцентная диагностика является объективным ме- тодом определения накопления ФС в биологической ткани. Перед каждым сеансом ФДТ и после были сняты спектры флюоресценции ФС, который накопился во влагалище и вульве у пациенток при аппликативном применении геля 5-АЛК, индуцирующего селективное накопление протопорфирина IX. Через 2 ч после введения тампона с 1,5% гелем 5-АЛК во влагалище была проведена флюоресцентная диагностика с помощью установки «ЛЭСА-01-Биоспек». Визуальная оценка накопления протопорфирина IX в тканях вульвы была проведена с использованием диодного лазера с дли- ной волны 400 нм (ООО «Полироник»). Статистическая оценка спектральных данных всех пациенток показала на- копление протопорфирина IX преимущественно в пора- женных участках слизистой влагалища и вульвы. Всем пациенткам проводилось 4 сеанса ФДТ лазером си- него света (длина волны 400 нм), 1 сеанс в 3 дня. Эффектив- ность лечения оценивалась на основании микроскопии мазков по Грамму, полимеразной цепной реакции в ре- жиме реального времени (Фемофлор), результатов бакте- риального исследования и спектрального анализа данных, т.е. флюоресцентной диагностики. Выбор ФС и источника возбуждающего излучения В данной работе исследовалось накопление ФС прото- Рис. 4. Спектры ОДО и флюоресценции, нормированные на спектр белого света, отраженного от BaS04. Рис. 5. Калибровочная кривая для определения концентрации про- топорфирина IX в ткани при возбуждении длиной волны 405 нм. Рис. 6. Концентрация протопорфирина IX до и после 1-го сеанса ФДТ. порфирина IX, который имеет определенные спектраль- ные характеристики (рис. 2). Для возбуждения ФС на небольшой глубине необходимо лазерное излучение с малой длиной волны, которое прони- кало бы не более чем на ≈1 мм. Таким образом, для возбуж- дения флюоресценции был выбран диодный лазер с дли- ной волны 405 нм (ЗАО «Биоспек», мощность 30 мВт), кото- рый попадает в полосу поглощения Соре (400 нм) и прони- кает не глубже чем на 1 мм. Оборудование для ФДТ Концентрация протопорфирина IX, мг/кг 8 7 6 5 4 3 2 1,00 1 0 1,00 3,87 2,28 До После 2,15 1,10 ФД проводилась с помощью установки «ЛЭСА-01-Биоспек» (рис. 3). Лазерное излучение подается через Y-образное диагно- стическое волокно к участку исследуемой ткани, при этом волокно находится в легком контакте с тканью. Каждый спектр регистрируется в течение 100 мс. У каждой из паци- енток были получены спектры от 3 типов тканей: кожа бедра, слизистая влагалища и вульвы. Количество спектров составило не менее 3 для каждой из выбранных точек. Мощность лазерного излучения для ди- агностики составила менее 30 мВт. Оборудование для ФДТ представлено на рис. 1. Методика измерений Протопорфирин IX, находящийся в ткани, при подаче возбуждающего излучения испускает флюоресцентные фотоны, которые затем поступают через диагностическое волокно к лазерному электронному спектроанализатору Бедро Влагалище Вульва (ЛЭСА) и обрабатываются, на экран программы UnoMo- mento выводится зависимость интенсивности излучения на каждой длине волны в выбранном диапазоне. В данном исследовании диапазон излучения составил 380-800 нм ввиду того, что пик лазерного излучения нахо- дится на длине волны 405 нм, а протопорфирин IX флюо- ресцирует на длинах волн 635 и 705 нм. Во избежание влия- ния внешних источников излучения измерения проводи- лись в темноте. Обработка спектров Перед сеансом ФДТ были сняты спектры флюоресценции и обратноотраженного лазерного излучения от кожи бедра, затем вульвы и влагалища, в том же порядке измере- ния производились и после сеанса ФДТ. Полученные спектры обрабатывались следующим образом: Анализировалось отношение площади под пиками флюоресценции в диапазоне 590-720 нм к площади под лазерным пиком в диапазоне 395-415 нм (индекс флюоресценции - ИФ). Рис. 7. Накопление протопорфирина IX до и после 2-го сеанса ФДТ. ИФ до и после ФДТ (2-й сеанс) 12 10,50 Спектры флюоресценции были поделены на обратноотраженный сигнал источника белого света (галогено- вая лампа) от BaSO4, чтобы избежать влияния аппарат- ной функции на полученные данные. Так как у оптических параметров, т.е. рассеяния и погло- щения, существует некая флуктуация от пациентки к паци- ентке, то для их учета каждый ИФ, снятый от влагалища и вульвы, был поделен на медиану (среднее значение для дан- ных, распределенных со сдвигом среднего значения, т.е. по 10 8 6 4 2 1,00 0 1,00 6,34 До После 4,16 3,47 распределению Пуассона) ИФ кожи бедра (нормальной ткани). ИФ выражается следующим образом: If= (S(M3..M4)/S(M1..M2))i/(S(M3..M4)/S(M1..M2))n, где Mi - маркеры, ограничивающие площадь S. Маркеры были выставлены следующим образом: M1 - 395 нм, M2 - 415 нм, M3 - 590 нм, M4 - 720 нм. Бедро Влагалище Вульва Рис. 8. Накопление протопорфирина IX до и после 3-го сеанса ФДТ. ИФ до и после ФДТ (3-й сеанс) 0,97 i - индекс - обозначает отношение площади под пиком флюоресценции (S(M3..M4)) к площади под пиком обратно- отраженного лазерного излучения (S(M1..M2)) для ткани влагалища или вульвы, n - аналогичное I отношение, но для нормальной ткани, т.е. кожи бедра. Калибровка спектрометра «ЛЭСА-01-Биоспек» В ходе исследования нами была получена калибровочная кривая для определения концентрации протопорфирина IX в ткани. Приготовлены флюоресцентные образцы: раствор Интралипида 1,2% в дистиллированной воде (что соответ- 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 1,00 До После 1,00 1,08 1,82 1,28 ствует реальной биологической ткани, т.е. в нашем случае - коже) и протопорфирин IX в разной концентрации (5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1 и 0 мг/кг). Полученные спектры были также нормированы на об- ратное диффузное отражение (ОДО) белого света от рас- твора Интралипида 1,2% в дистилированной воде и на ОДО лазерного излучения в том же растворе Интралипида, что в принципе исключает влияние рассеяния и поглощения ла- Бедро Влагалище Вульва Рис. 9. Накопление протопорфирина IX до и после 4-го сеанса ФДТ. ИФ до и после ФДТ (4-й сеанс) зерного излучения в ткани, т.е. позволяет сравнивать спек- тры ОДО лазерного излучения и флюоресцентного со спектрами, полученными от ткани пациентов, где таким же образом было исключено влияние флуктуаций рассеяния и поглощения от одной ткани к другой (т.е. от пациента к па- циенту) (рис. 4, 5). При анализе полученной кривой можно заключить, что ИФ, полученные в результате обработки, можно принять равными концентрации протопорфирина IX (в мг/кг) в ткани с ошибкой не более 3%. 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,81 1,00 До После 1,00 1,34 2,32 1,15 Результаты и выводы Был проведен статистический анализ для ИФ (т.е. для концентрации ФС) среди разных групп. Среди каждых двух групп анализ проводился с помощью критерия Манна-Уитни, среди трех групп - с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Группы разделены по следующим признакам: По сеансам (рис. 6-9). При анализе полученных данных очевидно, что разли- чия между накоплением ФС до сеанса в разных тканях и между 1, 2, 3 и 4-м сеансами статистически значимы (p<0,01). Отмечается, что после 4-го сеанса не было отли- чий накопления ФС в слизистой влагалища больных хро- ническим вульвовагинальным кандидозом и здоровой ткани, таким образом, возможно сделать вывод о высокой эффективности проведенной терапии. По изменению накопления ФС в тканях до сеанса ФДТ. По изменению накопления ФС в тканях после сеанса ФДТ. Исходя из полученных данных, можно заключить, что именно 4 сеанса ФДТ, проводимые 1 раз в 3 дня, являются достаточными для достижения лечебного эффекта. Эффек- тивность терапии составила 95% (р≤0,01). Кроме того, при долговременном наблюдении пациенток в течение 18 мес было выявлено снижение рецидивов до 5 раз. Бедро Влагалище Вульва Важно также отметить высокую эффективность ФДТ в лечении бактериального вагиноза и устойчивых к другим видам терапии неспецифических кольпитов. При анализе мазков по Граму и посевов отделяемого влагалища на пита- тельные среды отмечен значимый рост лактобактерий. Подробный анализ лабораторных исследований будет из- ложен в дальнейших публикациях. В настоящее время применение ФДТ-технологий для селек- тивной деструкции микроорганизмов и грибов находится в начале развития, однако анализ зарубежной и отечественной литературы, а также наш личный опыт показывает их огром- ный потенциал. ФДТ является также и альтернативным мето- дом лечения бактериальной и грибковой инфекции. Принципиальными отличиями ФДТ от иных методов яв- ляются: Бесконтактность (невозможность инфицирования па- циента). Безболезненность и бескровность лечебной про- цедуры. Снижение рецидивов в 5 раз. Эффективность лечения 95%. Особую актуальность данному направлению придают на- блюдаемое в последнее десятилетие резкое увеличение ре- зистентности многих штаммов микроорганизмов и грибов к антибиотикам и антимикотикам, а также разная чувстви- тельность Candida spp. к современным антимикотическим препаратам. Поэтому терапия кандидозных вульвовагини- тов, в том числе устойчивых к традиционным методам те- рапии, с помощью ФДТ в настоящее время является наибо- лее актуальной и перспективной.

About the authors

K O Aslanyan

Email: k_aslanyan@inbox.ru

I A Apolikhona

Email: apolikhina@inbox.ru

T A Teterina

Email: palpebra@inbox.ru

M N Kholodtsova

Email: m.kholodtsova@gmail.com

References

Supplementary files