Endothelial dysfunction in the first trimester of pregnancy

Full Text

В последнее время дисфункции эндотелия отводят важную роль в развитии акушерской и перинатальной патологии. В физиологических условиях организм беременной адаптирует сосудистый статус путем изменения продукции вазодилататоров и вазоконстрикторов, про- и антикоагулянтов, факторов роста и медиаторов воспаления, что связывают со стимуляцией эндотелия формирующимся фетоплацентарным комплексом [1]. Эмбрион, имплантируясь, повреждает стенку маточных сосудов, изменяя кровоток [2]. Отмечается рост выработки вазодилатирующих субстанций – простациклина и оксида азота (NO) [3]. Так, продукция основного вазодилататора NO возрастает с первых недель гестации: максимальная концентрация в плазме крови отмечается в 28 нед беременности и достигает 29 ммоль/л, в III триместре – снижается до 25 ммоль/л [1]. Уровень вазоконстриктора эндотелина-1 претерпевает схожие изменения во время беременности: его показатель в I триместре беременности 3,6 пг/мл, во II триместре достигает максимальной концентрации 8,7 пг/мл, а к родам снижается и составляет 6,6 пг/мл [4]. При гестации отмечается изменение концентрации в плазме крови сосудистых факторов роста – фактора роста эндотелия (VEGF) и плацентарного фактора роста (PlGF), источником которых является цитотрофобласт. В I триместре беременности увеличивается концентрация VEGF, тогда как в III триместре наблюдается повышение содержания в плазме PlGF [5].

При физиологически протекающей беременности отмечается рост тромботических факторов, синтезируемых эндотелиоцитами. Еще до имплантации в эндометрии повышается концентрация ингибитора активатора плазминогена (PAI-1) и тканевого фактора, снижается концентрация активаторов плазминогена. Во II триместре отмечается рост тромбогенных факторов эндотелиальной системы – фактора фон Виллебранда (vWf) и тромбоксана. К концу II триместра в сыворотке крови матери возрастает содержание тромбомодулина и фибронектина [1]. Умеренный гипофибринолиз при беременности важен для снижения кровоизлияний при вращении ворсин хориона в материнские сосуды. Цитопротективные свойства антикоагулянта протеина С облегчают инвазию трофобласта [6]. Эти данные позволяют предположить, что даже при физиологическом течении беременности изменение концентрации в сосудистом русле вазоактивных веществ создает предпосылки для развития эндотелиальной дисфункции.

Во время беременности состояние сосудистой системы проходит несколько стадий: в зависимости от уровня продукции эндотелиальных факторов различают стадию стимуляции, стадию активации и непосредственно эндотелиальную дисфункцию – фазу декомпенсации, сопровождающуюся функциональным угасанием, гибелью и десквамацией эндотелиальных клеток [7]. Состояние стимуляции и активации можно отнести к физиологическому проявлению работы эндотелиального аппарата в ходе становления фетоплацентарного комплекса. Развитие эндотелиальной дисфункции сигнализирует о декомпенсации эндотелия [8], что приводит в дальнейшем к развитию системных нарушений. Дефект имплантации плодного яйца в I триместре беременности ведет впоследствии к ишемии плаценты, определяет развитие фетоплацентарной недостаточности, которая инициирует большинство гестационных осложнений (невынашивание, преэклампсия, синдром задержки роста плода и др.), так как в их основе лежит единый патогенетический фактор – аномальный плацентарный ангио- и васкулогенез [9].

Известно большое количество методов диагностики эндотелиальной дисфункции. Как правило, состояние сосудистого эндотелия оценивается по количеству циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов (ДЭК), уровню метаболитов NO, концентрации С-реактивного белка (СРБ) или vWf в плазме крови, уровню альбумина в моче и т.п., либо с помощью выявления нарушений вазомоторной функции эндотелия инструментальными методами исследования. Следует констатировать, что применение классических методов диагностики эндотелиальной дисфункции в акушерстве имеет некоторые ограничения: сосудистая система во время беременности перестраивается, что необходимо учитывать при интерпретации полученных результатов, кроме того, введение вазоактивных препаратов функциональных проб не всегда допустимо у беременных, так как связано с возможностью негативного влияния на плод. Биохимическая диагностика эндотелиальной дисфункции также имеет ограничения. Состояние эндотелиоцитов теоретически может оцениваться по снижению синтеза NO – прямого показателя функции эндотелия, что, однако, лимитировано нестабильностью и коротким периодом жизни молекулы NO. Остальные же биохимические маркеры дают косвенную оценку функции эндотелия, так как сопровождают течение множества других сосудистых заболеваний или коагулопатий, а при беременности изменяют свою концентрацию и в физиологических условиях. Для выявления эндотелиальной дисфункции используют также цитологическую диагностику, заключающуюся в определении количества ДЭК в периферической крови. Метод малоинвазивен и не имеет ограничений для применения в акушерской практике. ДЭК – это циркулирующие в кровотоке эндотелиальные клетки, отделившиеся от стенки сосуда и являющиеся морфологическим параметром состояния микрососудистого русла [10]. Количество циркулирующих ДЭК в периферической крови в норме очень мало, так как процесс самообновления интимы сосудов проходит медленно, а десквамированные клетки интенсивно разрушаются ретикулоэндотелиальной системой. Повышение концентрации ДЭК в периферическом кровотоке отмечается при заболеваниях, сопровождающихся сосудистыми нарушениями (сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, нарушение мозгового кровообращения, васкулиты и т.п.) [11]. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции базируется на регистрации морфологических изменений исследуемой ткани, что является объективным критерием диагностики сосудистой патологии, определяя вероятность развития системных нарушений в организме.

Материалы и методы

В работе изучено состояние эндотелия у матери и плода в I триместре беременности. В исследование включены 180 женщин: контрольную группу составили 90 здоровых беременных, у которых был проведен медицинский аборт, в основную группу вошли 90 беременных с несостоявшимся выкидышем на сроке до 7–10 нед. Неразвивающуюся беременность можно охарактеризовать как финальную стадию нарушения маточно-плодных отношений. Критические изменения в микрососудистом русле при несостоявшемся выкидыше определили выбор данной нозологии для эффективного моделирования нарушений функции эндотелия во время гестации.

У всех беременных проведена цитологическая диагностика дисфункции эндотелия. Подсчет циркулирующих ДЭК в периферической крови осуществляли по методу J. Hladovec и соавт. (1978 г.) [12]: проводят забор крови и ее центрифугирование в течение 10 мин с последующим добавлением 0,1% раствора АДФ, пробирку встряхивают в течение 10 мин и повторно центрифугируют в течение 10 мин, из полученного супернатанта отбирают 0,2 мл. Для лучшей визуализации исследуемых клеток к раствору добавляют 20 мкл 0,1% раствора метиленового синего [13]. Через 5 мин проводят микроскопию полученного материала для выявления циркулирующих ДЭК в цитометрической камере (рис. 1). Подсчет проводят во всем объеме камеры Горяева (10 мкл). У одного пациента считают 10 проб по 10 мкл плазмы, суммируют полученные данные и устанавливают общее количество ДЭК, которое выражается в единицах на 100 мкл плазмы. Цитологические препараты мы исследовали с помощью микроскопа Leika DM 1000 и компьютерной видеоприставки Leika Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0. (2012 г.).

 

Рис. 1. ДЭК в камере Горяева. Окраска: метиленовый синий. Увеличение 600x.

 

В исследуемых группах были изучены биохимические маркеры поражения эндотелия:

1. Высокочувствительный СРБ сыворотки крови, определяемый методом иммунотурбидиметрии. СРБ отражает острую фазу воспаления, регулируется цитокинами и в последнее время ассоциируется в литературе с поражением сосудистой стенки [14].
2. vWf сыворотки крови, выявляемый методом иммуноферментного анализа. Изменение концентрации vWf в плазме крови отмечается при стимуляции или повреждении сосудистой стенки.
3. Альбумин мочи, определяемый высокочувствительным методом иммунотурбидиметрии. Микроальбуминурия (МАУ) – это выделение почками альбумина в минимальных количествах. Констрикция выносящей артериолы нефрона, одной из причин которой является эндотелиальная дисфункция, усиливает фильтрацию и увеличивает поступление альбуминов в первичную мочу. МАУ рассматривается как один из достоверных маркеров поражения эндотелия [15].
4. Белок апоптоза р53 в сыворотке крови, определяемый методом иммуноферментного анализа, – единственный показатель в нашем исследовании, который не относится к традиционным маркерам эндотелиальной дисфункции, нам был необходим для понимания патогенеза дисфункции эндотелия. Основным механизмом разрушения эндотелиоцитов является апоптоз. Белок р53 реагирует на поломки в молекуле ДНК клетки. При отсутствии повреждений белок р53 неактивен, а при возникновении дефектов ДНК переходит в активную форму, и его концентрация в плазме возрастает. Уровень белка р53 характеризует активность процессов апоптоза в организме, что может быть актуально в свете изучения патологии, сопряженной с деструкцией клеток сосудистой стенки.

Всего было проведено исследование биохимических маркеров поражения эндотелия у 51 пациентки: у 33 беременных в основной группе и у 18 беременных в контрольной группе.

Для оценки состояния эндотелия у плода проведено морфометрическое исследование сосудов хориона, полученного при инструментальном удалении плодного яйца. Исследовано 180 препаратов ворсинчатого хориона. Критерий включения гестационного срока определялся данными о состоянии эндотелия капилляров третичных ворсин, которые формируются к 7-й неделе беременности и до 10-й недели не содержат в составе своей стенки перицитов, что позволяет аутентифицировать толщину стенки фетального капилляра и толщину эндотелиоцита в третичных ворсинах хориона плода. Морфологический материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и проводили отбор блоков, из которых на ротационном микротоме готовили срезы толщиной 4–5 мкм, наклеивали их на химически чистые предметные стекла. После депарафинирования препаратов проводились окраска гематоксилином и эозином и обезвоживание. Исследование проводилось с использованием микроскопа Leika DM 1000 и компьютерной видеоприставки для обработки и анализа изображений Leika Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0. (2012 г.). Измерялись только сосуды с четким поперечным срезом без перицитов в своем составе (рис. 2).

 

Рис. 2. Сосуд хориона (10 нед). Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение 600x.

 

В ходе работы определялись следующие морфометрические параметры сосудов хориона плода:

1. Средняя толщина стенки сосуда.
2. Средний диаметр просвета сосуда.
3. Средняя площадь просвета сосуда.
4. Индекс Керногана – отношение толщины стенки сосуда к диаметру просвета сосуда.
5. Индекс апоптоза эндотелиоцитов – соотношение клеток с морфологическими признаками апоптоза к общему количеству исследуемых клеток. Апоптоз в эндотелиоцитах определялся путем сегментации при морфоденситометрии: фиксация порогового уровня сигнала в зоне плотности ядерного материала позволяла выделять участки компактизации, маргинации и фрагментации хроматина с формированием хроматомеров – денситометрический признак апоптоза клетки.

Статистическая обработка данных выполнена с использованием пакетов прикладных программ Statistica 10 и Excel (Microsoft Office Excel 2003). Для описания количественных показателей использовались среднее значение и стандартное отклонение. Для сравнения параметрических величин, рассчитанных на основе полученных выборок, проводилось вычисление коэффициента Стьюдента (t). Сравнение непараметрических величин осуществлялось с помощью критерия Манна–Уитни. Статистическая значимость фиксировалась на уровне вероятности ошибки р<0,05.

Результаты и обсуждение

Средний возраст у женщин в основной группе составил 30,9±2,62 года, в контрольной группе – 31,4±2,12 года. По показателям антропометрии группы были статистически сопоставимы. Следует отметить, что в группе с несостоявшимся выкидышем чаще встречались беременные с ожирением 2-й степени (6 человек, 6,7%). В контрольной группе ожирение 2-й степени выявлено только у 3 (3,3%) женщин. Гиподинамия в основной группе выявлена у 47 (51,1%) женщин, в контрольной группе малоподвижный образ жизни обнаружен только у 4 (4,4%) человек (p<0,001; t=8,6). Изучение частоты никотиновой зависимости показало достоверное отличие в исследуемых группах. В контрольной группе курили 37 (41,1%) человек, в группе с неразвивающейся беременностью – 13 (14,4%) человек (p<0,001; t=4,26). Курение, ожирение и гиподинамия сопряжены с поражением сосудистой системы, и изучение данных факторов актуально при изучении эндотелиальной дисфункции. Статистически значимых отличий при исследовании соматических заболеваний в группах не обнаружено. Артериальная гипертензия и сахарный диабет являются независимыми предикторами поражения эндотелия и были критериями исключения в программе нашего исследования.

При исследовании биохимических маркеров поражения эндотелия в исследуемых группах получены следующие результаты (рис. 3). Средний показатель высокочувствительного СРБ составил 3,3±2,12 мг/мл в группе с несостоявшимся выкидышем, и 1,8±0,84 мг/мл – у беременных контрольной группы (р=0,0056). Средняя концентрация vWf также превышала в группе с неразвивающейся беременностью соответствующий результат контрольной группы: 120,0±20,18% в основной и 101,6±9,47% – в контрольной группе (р=0,0005). Показатель МАУ оказался почти в 2 раза выше в группе с несостоявшимся выкидышем: в основной группе этот показатель составил 0,02±0,011 мкг/мл, и 0,01±0,006 мкг/мл – в контрольной (р=0,003). Концентрация маркера апоптоза белка р53 у беременных основной группы составила 0,01±0,011Ед/мл, и 0,003± 0,0013 Ед/мл у женщин контрольной группы (р=0,009).

 

Рис. 3. Графики распределения концентрации маркеров поражения эндотелия: а – СРБ; б – vWf; в – МАУ.

 

При цитологическом исследовании дисфункции эндотелия также получено достоверное отличие в группах (рис. 4). Среднее количество ДЭК у беременных контрольной группы составило 5,5±2,12×10⁴ клеток/100 мл. В группе с несостоявшимся выкидышем этот показатель был в 2 раза выше и составил 12,6±5,89×10⁴ клеток/100 мл (p<0,0001).

 

Рис. 4. График распределения количества ДЭК в исследуемых группах.

 

При проведении морфометрического исследования сосудов хориона в исследуемых группах получены следующие результаты (см. таблицу).

 

Сравнительная характеристика морфометрических параметров сосудов ворсинчатого хориона на сроке 7–10 нед (n=180) Comparative characteristics of morphometric parameters of chorionic vessels (n=180)
Показатель	Группы		Уровень значимости р
	основная (n=90)	контрольная (n=90)
Средняя толщина сосуда, мкм	0,7±0,11	0,9±0,12	<0,0001
Средний диаметр сосуда, мкм	6,7±0,38	6,9±0,93	<0,05
Средняя площадь сосуда, мкм2	36,1±4,62	39,8±10,96	<0,05
Индекс Керногана	0,05±0,008	0,06±0,017	<0,0001
Индекс апоптоза эндотелиоцитов, %	7,1±2,49	3,9±1,49	<0,0001

Примечание. Стрелками указаны скопления конденсированного хроматина.

Note. The arrows indicate clusters of condensed chromatin.

 

Толщина стенки капилляра, представленной только клетками эндотелия, а также индекс Керногана были достоверно выше в контрольной группе (р<0,0001). При этом показатели диаметра просвета и площади просвета сосудов были практически одинаковы в исследуемых группах, что говорит об унификации подбора калибра сосудов в исследовании с целью стандартизации определяемых морфометрических показателей. Индекс апоптоза эндотелиоцитов в группе невынашивания превысил показатель контрольной группы почти в 2 раза (р<0,0001). Достоверное отличие большинства изученных параметров позволяет утверждать, что морфометрические показатели сосудов ворсинчатого хориона могут являться маркером критических изменений в эндотелии первичных капилляров, характеризуя вероятность развития осложнений, сопряженных с патологией формирующегося фетоплацентарного комплекса.

Таким образом, полученные результаты продемонстрировали статистическую достоверность изменений исследованных параметров в группе с несостоявшимся выкидышем, что не противоречит литературным данным о роли дисфункции эндотелия в патогенезе невынашивания [2, 16, 17], а также актуализирует исследование состояния эндотелия в качестве важного теста ранней диагностики гестационных осложнений.

Достоверное увеличение индекса апоптоза эндотелиоцитов сосудов хориона, а также концентрации сывороточного белка р53 в группе с несостоявшимся выкидышем подтверждает роль апоптоза в патогенезе рассматриваемой патологии. Необходимо подчеркнуть, что при микроскопическом исследовании препаратов ДЭК нами были обнаружены изменения ядер клеток: фрагментация, маргинация и компактизация хроматина (рис. 5), что свидетельствует об участии апоптоза в патогенезе дисфункции эндотелия и открывает перспективы исследования данного заболевания на молекулярном уровне.

 

Рис. 5. ДЭК в камере Горяева. Окраска: метиленовый синий. Увеличение 600x.

 

Именно апоптоз эндотелиоцитов представляет форму повреждения, при которой происходит увеличение проницаемости сосудистой стенки для провоспалительных цитокинов и факторов роста, активируется система коагуляции, повышается адгезия лейкоцитов [18]. Индукция апоптоза часто сопровождает патологию гестации. Патоморфологическая картина спонтанного выкидыша характеризуется нарушением процессов кровообращения, наличием кровоизлияний, возникающих на фоне резко выраженной дезорганизации процессов апоптоза [19]. Формирование цитотрофобласта, васкулогенез в строме ворсин требуют адекватного снабжения кислородом и питательными веществами. Гипоксия тканей является индуктором апоптоза, определяя патогенез дисфункции эндотелия. Активизация апоптоза приводит к повреждению эндотелиальной выстилки, что влечет за собой нарушение формирования фетоплацентарного комплекса и развитие гестационных осложнений. Исследование апоптоза как маркера повреждения эндотелиоцитов открывает новые возможности диагностики сосудистой патологии, что в акушерстве расширяет перспективы снижения материнской и перинатальной заболеваемости.

Заключение

Эндотелиальная дисфункция означает нарушение сосудистого гомеостаза и приводит к критическим изменениям в микроциркуляторном русле, что на ранних сроках беременности нарушает процессы имплантации и инвазии трофобласта. Проведенный анализ актуализирует диагностику эндотелиальной дисфункции в качестве прогностического теста для обнаружения сосудистых нарушений у беременных. Исследование состояния эндотелия в I триместре беременности открывает новые возможности ранней малоинвазивной диагностики нарушений в системе мать–плацента–плод. Совершенствование методов своевременного выявления патологии фетоплацентарного комплекса представляет важнейшую задачу в акушерстве, определяя пути снижения материнской и перинатальной заболеваемости.

About the authors

Alexey V. Mironov

City Clinical Hospital №13; Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Author for correspondence.
Email: Mironov75av@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1490-7004

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Madina M. Umakhanova

Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: Mironov75av@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5204-4780

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Moscow

Alexandr V. Zhukocky

Federal Research and Clinical Center for Specialized Types of Medical Care and Medical Technologies

Email: Mironov75av@gmail.com

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files