Характеристики экспрессии протеомных маркеров у женщин с «тонким» эндометрием и их значение для терапевтических эффектов использования препаратов эстрадиола

Полный текст

Введение

Бесплодие и невынашивание беременности неясного генеза у женщин репродуктивного возраста остаются значимыми проблемами [1, 2]. При неясной причине репродуктивных неудач все бόльшее внимание уделяется рецептивным свойствам слизистой оболочки матки (СОМ) с целью определения значимости эндометриальной дисфункции как предиктора нарушений фертильности. Подозрение на неполноценность эндометриального интерфейса возникает, когда исключены другие причины отсутствия/невынашивания беременности.

Недостаточная толщина эндометрия (<7 мм) по данным ультразвукового исследования (УЗИ) в преовуляторные дни может быть самостоятельной причиной нарушения рецептивности [3, 4]. В специальной литературе представлены результаты изучения механизмов гормонально-рецепторных взаимодействий в эндометрии при его нормальной толщине [5, 6]. Однако в доступных источниках крайне мало информации о характеристиках рецептивности гипопластической СОМ.

Предикторами формирования «тонкого» эндометрия (ТЭ) и дополнительными факторами нарушения эндометриальной функции гипопластической СОМ могут быть посттравматические повреждения (последствия выскабливаний слизистой полости матки), гормональные причины (низкий уровень эстрадиола или высокое содержание мужских половых гормонов в периферической крови), воспалительные заболевания (хронический эндометрит), нарушения микроциркуляции (как проявление системной эндотелиальной дисфункции) [3, 7, 8]. При отсутствии перечисленных причин нарушения рецептивности ТЭ можно предположить, что имеет место дисбаланс протеомных маркеров (ПМ), в частности лейкемия-ингибирующего фактора (ЛИФ) и семейства FOX-белков (FOXA1, FOXA2).

В литературе опубликованы результаты исследования ЛИФ у женщин с нарушениями репродукции в анамнезе, однако ТЭ посвящены единичные работы. Не рассмотрены и FOX-белки у женщин с гипопластической СОМ. Кроме того, не известны факторы, которые определяют эффективность различных доз терапевтического применения препаратов эстрадиола у женщин с ТЭ. Соответственно, вопросы соотношения толщины СОМ и экспрессии маркеров ее рецептивности, лечения пациенток с ТЭ остаются актуальными.

Цель – проанализировать взаимосвязи между экспрессией ПМ эндометриальной рецептивности [рецепторов эстрогенов (ER), прогестерона (PR), ЛИФ, FOXA1, FOXA2] и показателями уровней половых стероидов [эстрадиола (Е₂), прогестерона (Р)] в периферической крови в период «окна имплантации» у женщин с нарушениями репродуктивной функции в анамнезе с ТЭ, оценить значение ПМ для терапевтического эффекта препаратов эстрадиола.

Материалы и методы

Проведено проспективное когортное сравнительное исследование. Сформировано 3 группы: основная – группа 1 (n=52) – женщины с ТЭ; сравнения – группа 2 (n=62) – женщины с нормальным по толщине эндометрием (в обеих группах отмечены нарушения фертильности неясного генеза в анамнезе); контрольная – группа 3 (n=16) – здоровые фертильные женщины.

Женщины группы 1 с ТЭ не имели очевидных причин формирования гипопластической СОМ. У всех участниц отмечен нормальный индекс массы тела, отсутствовали острые и хронические системные инфекционные заболевания, воспалительные заболевания органов малого таза, заболевания, сопряженные с повреждением сосудов, а также по данным гормонального обследования у них выявлен нормальный уровень мужских половых гормонов и эстрадиола в периферической крови. В семейном и личном анамнезе участниц не обнаружены указания на тромбоэмболические осложнения либо основания для углубленного гемостазиологического обследования. У пациенток групп 1 и 2 не выявлено значимых для реализации репродуктивной функции соматических и гинекологических заболеваний. Маточные трубы у них были проходимыми, а также имела место нормозооспермия у партнеров. Мы предположили, что у женщин приведенных групп причиной репродуктивных неудач неясного генеза может быть эндометриальная дисфункция.

Исследование проведено на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» (дизайн исследования утвержден локальным этическим комитетом – выписка из протокола №8 от 11.11.2020).

У всех женщин менструальный цикл (МЦ) составлял 28–30 дней. С целью определения уровней Е₂, Р в образцах периферической крови использовали иммуноферментный и хемилюминесцентный методы. Венепункцию из локтевой вены проводили на 6–8-й день после овуляции (д.п.о.) в цикле выполнения биопсии эндометрия.

В двух МЦ подряд и в МЦ, в котором выполняли внутриматочное вмешательство, проводили УЗИ органов малого таза (мониторировали толщину эндометрия, рост фолликула и овуляцию). «Тонким» считали эндометрий, величина М-эхо которого составляла менее 7 мм, что определяли по данным УЗИ на 11–13-й день МЦ (д.м.ц.) при его длительности 28–30 дней [3, 9, 10].

На 6–8-й д.п.о. всем участницам исследования проводили вакуум-аспирационную биопсию эндометрия с использованием урогенитального зонда типа Pipelle (вмешательство осуществляли на фоне нормобиоценоза урогенитального тракта и использования барьерного метода контрацепции) для последующего гистологического и иммуногистохимического исследований биоптатов эндометрия [определение ER, PR (максимальный счет – 300), ЛИФ, FOXA1, FOXA2] на базе ФГБУ «ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова» и ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова». У пациенток, включенных в исследование, не отмечено морфологических критериев диагноза «хронический эндометрит».

Для обработки полученных результатов использовали прикладные программы MS Excel, IBM SPSS 23, Statistica portable v.13.5. Количественные показатели оценивали непараметрическими (критерии Краскела–Уоллиса, Манна–Уитни) методами, а качественные – двусторонним критерием Фишера. Проведен логико-структурный анализ с определением отношения шансов для выявления пороговых уровней счета ER, PR в железах и строме эндометрия, которые могут являться существенными для эндометриальной экспрессии ЛИФ, FOX-белков. Для изучения статистических взаимосвязей между показателями использовали непараметрический коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали значимыми при p<0,05.

Эффект терапевтического применения препаратов экзогенного эстрадиола оценивали у участниц основной группы с ТЭ. Исследование являлось длительным, а его выполнение пришлось на период пандемии инфекционного заболевания COVID-19 (согласно данным Всемирной организации здравоохранения, с 11 марта 2020 г. по 5 мая 2023 г.), в связи с чем 26 из 52 женщин основной группы отложили реализацию репродуктивных планов на неопределенный срок и не получали лечение.

В нашем исследовании 16 женщин основной группы (из 26 участниц, решивших продолжить реализацию репродуктивной функции) получали терапию препаратами половых стероидов – препараты экзогенного эстрадиола с 5-го по 25-й д.м.ц. и гестагены (дидрогестерон, микронизированный прогестерон) для поддержания секреторной фазы МЦ.

Результаты

В литературе описано [11, 12], что предикторами нарушений рецептивности СОМ могут быть возраст пациентки, сывороточные уровни E₂, P, величина М-эхо эндометрия, наличие в анамнезе инфекций, передающихся половым путем, внутриматочные вмешательства.

Оценено влияние приведенных факторов при распределении участниц исследования (n=130) по варианту гормон-рецепторного «ответа» эндометрия – иммунофенотипа-1 (ИФТ-1) и ИФТ-2, 3, 4 [13] (табл. 1). ИФТ-1 – вариант экспрессии ER, PR в железах и строме эндометрия у здоровых женщин, ИФТ-2, 3, 4 – отличные от здоровых фертильных женщин варианты эндометриальной экспрессии ER, PR [13].

 

Таблица 1. Результаты многофакторного дискриминантного анализа лабораторных и анамнестических данных пациенток, включенных в исследование, с использованием критерия Манна–Уитни: факторы, существенные для экспрессии ER, PR в эндометрии

Table 1. Results of multivariate discriminant analysis of laboratory and medical history data of patients included in the study using the Mann–Whitney test: significant factors for ER and PR expression in the endometrium

№	Показатели	Гормонально-рецепторный «ответ» эндометрия		р
		ИФТ-1	ИФТ-2, 3, 4
1	Возраст	32,9	32,4	0,6
2	Уровень Е2 в крови	691,5	616	0,1
3	Уровень Р в крови	43,3	46,3	0,2
4	Инфекции, передающиеся половым путем, в анамнезе	0,2	0,3	0,08
5	Наличие внутриматочного вмешательства в анамнезе (выскабливание полости матки)	0,3	0,5	0,3
6	Повторные (два и более) внутриматочные вмешательства в анамнезе (выскабливание полости матки)	0,6	1,01	0,02

 

Определено, что существенным для экспрессии в эндометрии ER, PR фактором является наличие повторных внутриматочных вмешательств в анамнезе.

Для уточнения значимости описанных факторов как предрасполагающих к формированию ТЭ проведен анализ тех же показателей с учетом разделения участниц исследования по критерию величины М-эхо (табл. 2).

 

Таблица 2. Результаты многофакторного дискриминантного анализа лабораторных и анамнестических данных пациенток, включенных в исследование, с использованием критерия Манна–Уитни: факторы, существенные для толщины эндометрия

Table 2. Results of multivariate discriminant analysis of laboratory and medical history data of patients included in the study using the Mann–Whitney test: significant factors for endometrial thickness

№	Показатели	Толщина эндометрия		р
		М-эхо<7 мм	М-эхо≥7 мм
1	Возраст	33	32,2	0,5
2	Уровень Е2 в крови	665,3	595,1	0,1
3	Уровень Р в крови	44,7	47,7	0,6
4	Инфекции, передающиеся половым путем, в анамнезе	0,3	0,4	0,2
5	Факт наличия внутриматочного вмешательства в анамнезе (выскабливание полости матки)	0,5	0,6	0,2
6	Повторные (два и более) внутриматочные вмешательства в анамнезе (выскабливание полости матки)	0,8	0,9	0,4

 

По результатам многофакторного дискриминантного анализа не выявлено лабораторно-анамнестических факторов, значимых для формирования ТЭ при условии нормоэстрогенемии в периферической крови.

В нашем многокомпонентном исследовании проведен сравнительный анализ экспрессии ЛИФ, FOX-белков у здоровых фертильных женщин, у женщин с репродуктивными трудностями в анамнезе при различной толщине эндометрия и их соотношений между собой (6–8-й д.п.о.).

У здоровых женщин определены следующие показатели экспрессии ПМ в слизистой тела матки (6–8-й д.п.о.): выраженная экспрессия ЛИФ, сниженная экспрессия FOXA1, выраженная экспрессия FOXA2.

У пациенток основной группы с ТЭ (n=52) практически в 1/2 случаев выявлены отличные от здоровых женщин характеристики эндометриальной экспрессии ПМ: 38% (n=17 из 45 образцов эндометрия) – сниженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии, 33% (n=17 из 52) – в железах, 54% (n=28 из 52) – в строме СОМ, 42% (n=22 из 52) – выраженная эндометриальная экспрессия FOXA1, 56% (n=29 из 52) – сниженная экспрессия FOXA2.

В группе сравнения у пациенток с нормальным М-эхо и репродуктивными нарушениями в анамнезе (n=62) отличные от здоровых женщин варианты экспрессии ПМ в эндометрии встречались реже, чем в основной группе: 16% (n=7 из 45 образцов эндометрия) – сниженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии, 19% (n=12 из 62) – в железах, 63% (n=39 из 62) – в строме СОМ, 27% (n=17 из 62) – выраженная эндометриальная экспрессия FOXA1, 8% (n=5 из 62) – сниженная экспрессия FOXA2.

Все отличия при сравнении экспрессии ЛИФ, FOX-белков в эндометрии являлись достоверными между женщинами с «тонкой» СОМ и женщинами из группы контроля (р<0,05). При сравнении эндометриальной экспрессии изученных ПМ у женщин с ТЭ и у женщин с нормальной величиной М-эхо из группы сравнения выявлены достоверные отличия в отношении следующих характеристик (р<0,05): ЛИФ в люминальном эпителии, в железах, FOXA2 в эндометрии.

Результаты проведенного анализа отражают значительно более частые нарушения экспрессии ЛИФ, FOXA1, FOXA2 в ТЭ, чем в нормальном по толщине эндометрии, в том числе у женщин с нарушениями фертильности в анамнезе.

Проведен корреляционный анализ экспрессии изученных ПМ рецептивности между собой и значениями E₂ и P в периферической крови для определения их ассоциаций (использовали коэффициент корреляции Спирмена); табл. 3.

 

Таблица 3. Эмпирические значения корреляционного анализа Спирмена между значениями Е₂ и Р в крови, величиной М-эхо, эндометриальной экспрессией рецепторов половых стероидов (ER, PR) и протеомных молекул (ЛИФ, FOX-белки)

Table 3. Empirical values of Spearman's correlation analysis between blood levels of E₂ and P, M-echo value, endometrial expression of sex steroid receptors (ER, PR) and proteomic molecules (leukemia-inhibiting factor – LIF, FOX proteins)

Показатели	E2	P	ER железы	ER строма	PR железы	PR строма	ЛИФ люм.	ЛИФ железы	ЛИФ строма	FOXA1	FOXA2
М-эхо	0,091	-0,111	-0,095	-0,024	-0,113	-0,017	0,008	0,175	-0,032	-0,145	0,422
E2		0,456	-0,012	0,04	-0,102	0,061	-0,071	-0,006	0,03	0,133	0,031
P			0,056	0,066	0,075	0,133	-0,054	-0,052	0,061	0,006	-0,98
ER железы				0,635	0,696	0,339	0,034	-0,053	0,111	-0,054	0,042
ER строма					0,342	0,295	-0,113	-0,014	-0,012	0,057	-0,009
PR железы						0,345	0,103	-0,025	0,193	-0,028	0,001
PR строма							0,016	0,078	0,079	-0,096	0,074
ЛИФ люм.								0,381	0,353	0,187	-0,119
ЛИФ железы									0,407	0,242	0,071
ЛИФ строма										0,239	-0,094
FOXA1											-0,082

 

По результатам корреляционного анализа не выявлено значимых связей между уровнями Е₂, Р в крови (при условии нормоэстрогенемии, овуляторного значения Р у пациенток, включенных в исследование) и величиной М-эхо, а также не установлено ассоциаций между сывороточными уровнями Е₂, Р и выраженностью экспрессии ER, PR в железах и строме эндометрия или выраженностью эндометриальной экспрессии ЛИФ, FOX-белков.

В то же время корреляционный анализ позволил выявить, что существуют значимые умеренные положительные взаимосвязи между величиной М-эхо и экспрессией FOXA2 в эндометрии (r=0,422; p<0,001). Чем в большей степени выражены показатели значения М-эхо, тем больше экспрессия FOXA2 в эндометрии (по применяемой нами градации «высокая/невысокая» оценки экспрессии FOXA2).

Определено, что существуют значимые корреляционные взаимосвязи между показателями эндометриальной экспрессии ER, PR. Выявлены: существенные средние положительные взаимосвязи между показателями ER в железах и ER в строме (r=0,635; p<0,001); значимые средние положительные взаимосвязи между выраженностью экспрессии ER и PR в железах (r=0,696; p<0,001); значимые умеренные положительные взаимосвязи между выраженностью экспрессии ER в железах и PR в строме эндометрия (r=0,339; p<0,001); значимые слабые положительные взаимосвязи между экспрессией ER в строме и экспрессией PR в строме эндометрия (r=0,295; p<0,01).

С помощью проведенного корреляционного анализа установлено, что экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии, железах и строме эндометрия являются в определенной степени сопряженными процессами: выявлены умеренные положительные взаимосвязи между эндометриальной экспрессией ЛИФ в люминальном эпителии и ЛИФ в железах (r=0,381; p<0,001), а также между экспрессией ЛИФ в люминальном эпителии и ЛИФ в строме (r=0,353; p<0,001). Слабые положительные взаимосвязи определены между экспрессией ЛИФ в люминальном эпителии и экспрессией FOXA1 в эндометрии (r=0,187; p<0,05).

В литературе описаны условные пороговые значения счета ER, PR в эндометрии (максимальный счет – 300), значимые для экспрессии ПМ эндометриальной рецептивности: для PR в железах – 105, для ER в железах – 145, для ER в строме – 155 [14].

Проведен логико-структурный анализ для оценки значимости пороговых уровней счета ER, PR в железах и строме эндометрия для экспрессии ЛИФ, FOX-белков в эндометрии. Для решения данной задачи использовали теорию шансов и вычисление отношения шансов (ОШ).

Определено, что у женщин с «гиперэкспрессией» PR в железах эндометрия (H-score>105; 6–8-й д.п.о.) риск отличной от здоровых женщин экспрессии ПМ в слизистой тела матки выше, чем у женщин с низкой экспрессией PR в эндометриальных железах (H-score<105): в 1,2 раза выше шанс сниженной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии, в 1,7 – ЛИФ в железах, в 1,4 – риск отличной от здоровых женщин экспрессии FOXA1 в слизистой тела матки, в 1,9 – риск сниженной экспрессии FOXA2 (табл. 4).

 

Таблица 4. Отношение шансов отличия эндометриальной экспрессии ЛИФ и FOX-белков от здоровых женщин при счете PR в железах эндометрия более 105 (6–8-й д.п.о.)

Table 4. The odds ratio (OR) for the difference in endometrial expression of LIF and FOX proteins from healthy women when the PR count in the endometrial glands is more than 105 (6–8 days after ovulation)

Показатели	Фактор есть (PR в железах более 105), абс. (%)	Фактора нет (PR в железах менее 105), абс. (%)	р	OR	95% доверительный интервал для ОШ
Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии)	15 (25)	10 (22)	0,03	1,2±0,4	0,5–2,9
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии)	45 (75)	36 (78)
Экспрессия ЛИФ в железах
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в железах)	20 (27)	10 (18)	0,02	1,7±0,2	0,7–4
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в железах)	54 (73)	46 (82)
Экспрессия ЛИФ в строме
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в строме)	39 (53)	30 (54)	0,05	0,97±0,3	0,5–1,9
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в строме)	35 (47)	26 (46)
Экспрессия FOXA1 в эндометрии
Исход есть (выраженная экспрессия FOXA1 в эндометрии)	24 (32)	14 (25)	0,03	1,4±0,4	0,6–3,1
Исхода нет (сниженная экспрессия FOXA1 в эндометрии)	50 (68)	41 (75)
Экспрессия FOXA2 в эндометрии
Исход есть (сниженная экспрессия FOXA2 в эндометрии)	24 (32)	11 (20)	0,01	1,9±0,2	0,8–4,4
Исхода нет (выраженная экспрессия FOXA2 в эндометрии)	50 (68)	44 (80)
Примечание. Здесь и далее в табл. 5–10: у 100% здоровых женщин контрольной группы определяли следующие характеристики ПМ: выраженная экспрессия ЛИФ, сниженная экспрессия FOXA1, выраженная экспрессия FOXA2 (6–8-й д.п.о.).

 

При еще более выраженной «гиперэкспрессии» PR в железах эндометрия (H-score>285) риски отличной от контрольной группы экспрессии ПМ рецептивности еще более высокие: шанс сниженной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии выше в 1,7 раза, ЛИФ в железах эндометрия – в 3,6, ЛИФ в строме – в 1,7, отличия от здоровых (повышения) экспрессии FOXA1 – в 7,4, риск сниженной экспрессии FOXA2 – в 8,4, чем при счете PR в эндометриальных железах менее 285.

При экспрессии ER в эндометриальных железах (6–8-й д.п.о.) более 145 определен риск снижения эндометриальной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии в 2,8 раза, ЛИФ в железах – в 1,9, ЛИФ в строме – в 1,6, риск повышенной (отличной от здоровых женщин) FOXA1 – в 1,3, риск сниженной экспрессии FOXA2 – в 1,8, чем у женщин, у которых счет ER в железах эндометрия составлял менее 145 (табл. 5).

 

Таблица 5. ОШ отличия эндометриальной экспрессии ЛИФ и FOX-белков от здоровых женщин при счете ER в железах эндометрия более 145 (6–8-й д.п.о.)

Table 5. The OR for the difference in endometrial expression of LIF and FOX proteins from healthy women when the ER count in the endometrial glands is more than 145 (6–8 days after ovulation)

Показатели	Фактор есть (ER в железах более 145), абс. (%)	Фактора нет (ER в железах менее 145), абс. (%)	р	ОШ	95% доверительный интервал для ОШ
Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии)	19 (31)	6 (14)	0,01	2,8±0,3	1–7,8
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии)	43 (69)	38 (86)
Экспрессия ЛИФ в железах
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в железах)	21 (28)	9 (17)	0,01	1,9±0,4	0,8–4,6
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в железах)	55 (72)	45 (83)
Экспрессия ЛИФ в строме
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в строме)	44 (58)	25 (46)	0,02	1,6±0,3	0,8–3,2
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в строме)	32 (42)	29 (54)
Экспрессия FOXA1 в эндометрии
Исход есть (выраженная экспрессия FOXA1 в эндометрии)	24 (32)	14 (26)	0,04	1,3±0,2	0,6–2,8
Исхода нет (сниженная экспрессия FOXA1 в эндометрии)	52 (68)	39 (74)
Экспрессия FOXA2 в эндометрии
Исход есть (сниженная экспрессия FOXA2 в эндометрии)	24 (32)	11 (21)	0,02	1,8±0,2	0,8–4
Исхода нет (выраженная экспрессия FOXA2 в эндометрии)	52 (68)	42 (79)

 

При «высокой» экспрессии ER в строме эндометрия (H-score>155; 6–8-й д.п.о.) риск сниженной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии, железах и строме был выше в 1,7, 2,0 и 1,4 раза соответственно, риск повышенной (отличной от здоровых женщин) экспрессии FOXA1 – в 1,2, риск сниженной экспрессии FOXA2 – в 1,6 раза, чем у женщин с экспрессией ER в строме эндометрия менее 155 (табл. 6).

 

Таблица 6. ОШ отличия эндометриальной экспрессии ЛИФ и FOX-белков от здоровых женщин при счете ER в строме эндометрия более 155 (6–8-й д.п.о.)

Table 6. The OR for the difference in endometrial expression of LIF and FOX proteins from healthy women when the ER count in the endometrial stroma is more than 155 (6-8 days after ovulation)

Показатели	Фактор есть (ER в строме более 155), абс. (%)	Фактора нет (ER в строме менее 155), абс. (%)	р	ОШ	95% доверительный интервал для ОШ
Экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии)	16 (28)	9 (18)	0,03	1,7±0,2	0,7–4,4
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в люминальном эпителии)	41 (72)	40 (82)
Экспрессия ЛИФ в железах
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в железах)	20 (29)	10 (17)	0,01	2,0±0,4	0,8–4,7
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в железах)	50 (71)	50 (83)
Экспрессия ЛИФ в строме
Исход есть (сниженная экспрессия ЛИФ в строме)	40 (57)	29 (48)	0,04	1,4±0,3	0,7–2,8
Исхода нет (выраженная экспрессия ЛИФ в строме)	30 (43)	31 (52)
Экспрессия FOXA1 в эндометрии
Исход есть (выраженная экспрессия FOXA1 в эндометрии)	22 (31)	16 (27)	0,04	1,2±0,4	0,6–2,7
Исхода нет (сниженная экспрессия FOXA1 в эндометрии)	48 (69)	43 (73)
Экспрессия FOXA2 в эндометрии
Исход есть (сниженная экспрессия FOXA2 в эндометрии)	22 (31)	13 (22)	0,03	1,6±0,2	0,7–3,6
Исхода нет (выраженная экспрессия FOXA2 в эндометрии)	48 (69)	46 (78)

 

Результаты логико-структурного анализа показали, что выявленные пороговые значения счета ER, PR в эндометрии (для PR в железах – 105 и 285, для ER в железах – 145, для ER в строме – 155) могут являться прогностическими факторами выраженности экспрессии ЛИФ, FOX-белков в слизистой тела матки.

По итогам расширенного математико-статистического анализа данных пациенток, включенных в исследование, получены следующие наиболее важные результаты:

1) два выскабливания СОМ и более в анамнезе являются значимым предиктором нарушения рецептивности эндометрия, независимо от его толщины, однако приведенный факт анамнеза не ассоциирован с уменьшением М-эхо;

2) уровни сывороточных Е₂, Р (при нормоэстрогенемии и овуляторных значениях Р) не являются предикторами формирования ТЭ и не определяют изученные показатели его рецептивности;

3) «гиперэкспрессия» рецепторов половых стероидов в эндометрии (6–8-й д.п.о.) может быть важным прогностическим маркером выраженности экспрессии ЛИФ, FOXA1, FOXA2 в нем при анамнезе нарушений репродуктивной функции в сравнении со здоровыми фертильными женщинами.

В нашем исследовании одной из задач являлась оценка эффектов терапевтического применения препаратов экзогенного эстрадиола у женщин с ТЭ, а также сопоставление у них характеристик эндометриальной экспрессии изученных ПМ с результатами лечения.

Пациентки с гипопластическим эндометрием получали препараты экзогенного эстрадиола с 5-го по 25-й д.м.ц., а также гестагены (дидрогестерон, микронизированный прогестерон) для поддержания II фазы МЦ.

В связи с пандемией инфекционного заболевания COVID-19 (согласно данным Всемирной организации здравоохранения, с 11 марта 2020 г. по 5 мая 2023 г.), 31 (59,6%) женщин из 52, включенных в основную группу, отказались от планирования беременности и какой-либо терапии, отложив реализацию репродуктивной функции на неопределенный срок.

У других 21 женщины (40,4% основной группы), которые не поменяли репродуктивных планов, с помощью УЗИ оценивали динамику изменения М-эхо в преовуляторные дни. Так, 16 женщин с ТЭ из 21 в данной когорте получали 1,0 мг эстрадиола гемигидрата в форме трансдермальных гелей по 1 дозе геля в сутки или 1,5 мг эстрадиола в 1 дозе геля в соответствии с инструкцией лекарственного препарата. Первичной целью применения препаратов эстрадиола было увеличение М-эхо на 11–13-й д.м.ц. (при его длительности 28–30 дней) по данным УЗИ. Конечной целью считалось наступление беременности, что могло косвенно подтверждать преодоление нарушений рецептивности СОМ.

Из 16 женщин с ТЭ, получавших лечение препаратами эстрадиола в начальной дозировке, у 4 отмечена положительная динамика терапии в виде усиления пролиферации эндометрия (по данным УЗИ на 11–13-й д.м.ц. М-эхо≥7 мм). У этих 4 женщин в 75% случаев выявлены полноценная фазовая трансформация эндометрия, экспрессия ER, PR, FOX-белков в эндометрии, в 100% случаев – эндометриальная экспрессия ЛИФ, сходные со здоровыми женщинами (табл. 7).

 

Таблица 7. Результаты гистологического и иммуногистохимического исследований эндометриальных биоптатов (6–8-й д.п.о.)у женщин основной группы, получавших терапию препаратами эстрадиола в стандартных дозировках с положительной динамикой М-эхо

Table 7. Results of histological and immunohistochemical studies of endometrial biopsy (6–8 days after ovulation) specimens in women of the main group treated with standard doses of estradiol with M-echo improvement

Фамилия пациента, возраст	ИФТ	Фазовая трансформация	Экспрессия ЛИФ	Экспрессия FOX-белков
К., 34	1	Полноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная; FOXA2 – выраженная
М., 33	1	Полноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная; FOXA2 – выраженная
М., 33	1	Полноценная секреторная	Выраженная	Отличная от здоровых женщин
П., 35	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA2 – выраженная

 

У остальных 12 женщин, получавших терапию препаратами экзогенного эстрадиола, не отмечено усиления пролиферации эндометрия при использовании начальных дозировок эстрадиола гемигидрата (1,0–1,5 мг/сут). В изученной литературе описаны результаты исследований, в которых отражено, что в ряде случаев дозировка препаратов эстрадиола, способствующая существенному усилению пролиферации СОМ при ее изначальной малой толщине, составляет 4 мг/сут [15]. Учитывая приведенные данные, мы увеличили дозировку препаратов эстрадиола до 4 мг/сут (пациентки подписывали информированное согласие). При использовании бόльшей дозы экзогенного эстрадиола у 11 из данных 12 женщин получен положительный эффект терапии в виде значительного увеличения толщины эндометрия (величина М-эхо составляла более 7 мм на 11–13-й д.м.ц. при его длительности 28–30 дней). У 1 пациентки не выявлено эффекта в виде усиления пролиферации слизистой тела, однако наступила беременность, которая закончилась живорождением в доношенном сроке беременности (М-эхо в цикле зачатия на 13-й д.м.ц. – 6 мм).

У участниц исследования (n=12), которым потребовалось увеличение дозировки экзогенного эстрадиола, в 100% случаев выявлены отличные от здоровых женщин гормон-рецепторные характеристики эндометрия (ИФТ-2, 3, 4), в 83% случаев имела место неполноценная фазовая трансформация СОМ. При этом эндометриальная экспрессия ЛИФ, FOX-белков в большинстве случаев являлась сходной с группой контроля (табл. 8).

 

Таблица 8. Результаты гистологического и иммуногистохимического исследований эндометриальных биоптатов (6–8-й д.п.о.)у женщин основной группы, получавших терапию препаратами эстрадиола в повышенных дозировках с положительной динамикой М-эхо или наступлением беременности

Table 8. Results of histological and immunohistochemical studies of endometrial biopsy (6–8 days after ovulation) specimens in women of the main group treated with higher doses of estradiol with M-echo improvement or pregnancy

Фамилия пациента, возраст	ИФТ	Фазовая трансформация	Экспрессия ЛИФ	Экспрессия FOX-белков
Б., 25	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная
В., 28	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	Отличная от здоровых женщин
В., 30	2	Полноценная секреторная	Сниженная	FOXA1 – сниженная
Д., 34	2	Неполноценная секреторная	Сниженная	FOXA1 – сниженная
Д., 23	2	Неполноценная секреторная	Сниженная	FOXA1 – сниженная
К., 32	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	Отличная от здоровых женщин
П., 39	3	Неполноценная секреторная	Сниженная	FOXA1 – сниженная; FOXA2 – выраженная
Р., 38	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная; FOXA2 – выраженная
Т., 34	3	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная
Ф., 29	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	Отличная от здоровых женщин
Ф., 34	4	Полноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная
Ч., 33	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA2 – выраженная

 

Наиболее значимым эффектом применения препаратов экзогенного эстрадиола у пациенток с ТЭ считали наступление беременности. За время проведения исследования у 10 (47,6%) из 21 женщины основной группы (которые сохранили планы на реализацию репродуктивной функции) наступила беременность, 5 из 10 получали препараты половых стероидов (у 4 отмечено увеличение М-эхо на фоне терапии). У 2 из них беременность наступила в естественном цикле зачатия и закончилась в одном случае родами здорового ребенка в доношенном сроке беременности (пациентка с диагнозом «невынашивание беременности»), во втором – неразвивающейся беременностью раннего срока (пациентка с первичным бесплодием). У 3 пациенток, использовавших терапию экзогенным эстрадиолом, беременность наступила в цикле экстракорпорального оплодотворения (все пациентки с диагнозом «бесплодие»): у 2 из них имела место неразвивающаяся беременность на раннем сроке, у 1 – роды в доношенном сроке (у нее зачатие произошло при ТЭ при отсутствии его пролиферации на фоне лечения эстрадиолом). У приведенных 5 женщин в 100% случаев терапия была эффективна в плане преодоления проблем репродуктивной дисфункции: у 1 пациентки с невынашиванием беременности в анамнезе произошли срочные роды, у 4 женщин преодолено бесплодие в анамнезе. У данных женщин выявлены следующие гистологические и иммуногистохимические характеристики эндометрия: в 75% случаев – отличные от здоровых женщин варианты экспрессии ER, PR, неполноценная фазовая трансформация эндометрия, в 75% – сходная с группой контроля экспрессия ЛИФ и FOXA1, в 60% – выраженная экспрессия FOXA2, как у здоровых женщин (табл. 9).

 

Таблица 9. Результаты гистологического и иммуногистохимического исследований эндометриальных биоптатов (6–8-й д.п.о.) у женщин основной группы, получавших терапию препаратами эстрадиола, у которых за время исследования наступила беременность

Table 9. Results of histological and immunohistochemical studies of endometrial biopsy (6–8 days after ovulation) specimens in women of the main group treated with estradiol, who became pregnant during the study

Фамилия пациента, возраст	Вид репродуктивной дисфункции	Исход. М-эхо, мм	ИФТ	Фазовая трансформация	Экспрессия ЛИФ	Экспрессия FOX-белков
Д., 23	НБ	6,5	2	Неполноценная секреторная	Сниженная	FOXA1 – сниженная
К., 34	St II	6,7	1	Полноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная; FOXA2 – выраженная
Р., 38	St II	6,5	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная; FOXA2 – выраженная
Т., 34	St I	6,9	3	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная
Ч., 33	St I	6	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA2 – выраженная

 

За время исследования у остальных 5 из 10 женщин беременность наступила самостоятельно до начала применения препаратов эстрадиола, т.е. они планировали лечение, но не успели его начать. Никаких методов контрацепции в парах не применяли. В литературе приведены данные о том, что самостоятельная беременность возможна при наличии ТЭ [16, 17]. Всем участницам приведенной когорты поставлен диагноз «бесплодие неясного генеза», в 100% случаев данная репродуктивная проблема преодолена. У 3 пациенток гестация завершена срочными родами, у 2 имела место неразвивающаяся беременность раннего срока. В 80% случаев в изученной когорте из 5 женщин выявлены отличные от контрольной группы характеристики экспрессии ER, PR в эндометрии, в 60% определена неполноценная фазовая трансформация слизистой тела матки и сниженная экспрессия ЛИФ, однако выявлена сходная со здоровыми женщинами экспрессия FOXA1 и/или FOXA2 (табл. 10). Толщина эндометрия на 11–13-й д.м.ц. по данным УЗИ у приведенной когорты из 5 женщин составляла 4,6–6 мм.

 

Таблица 10. Результаты гистологического и иммуногистохимического исследований эндометриальных биоптатов (6–8-й д.п.о.) у женщин основной группы, у которых за время исследования самостоятельно наступила беременность

Table 10. Results of histological and immunohistochemical studies of endometrial biopsy (6–8 days after ovulation) specimens in women of the main group, who became pregnant spontaneously during the study

Фамилия, возраст	Вид репродуктивной дисфункции	Исх. М-эхо, мм	ИФТ	Фазовая трансформация	Экспрессия ЛИФ	Экспрессия FOX-белков
А., 38	St I	4,7	1	Полноценная секреторная	Сниженная	FOXA1 – сниженная
С., 27	St II	5	2	Неполноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная; FOXA2 – выраженная
Т., 32	St I	4,7	2	Неполноценная секреторная	Сниженная	FOXA1 – сниженная
У., 37	St I	6	4	Неполноценная секреторная	Сниженная	FOXA1 – сниженная; FOXA2 – выраженная
Ч., 36	St I	4,6	4	Полноценная секреторная	Выраженная	FOXA1 – сниженная

 

В целом у 21 пациентки, у которых наступила беременность и/или отмечено увеличение М-эхо на фоне лечения препаратами половых стероидов, в большинстве случаев эндометриальная экспрессия ЛИФ и FOX-белков являлась сходной с женщинами группы контроля: в 67% – экспрессия ЛИФ, в 81% – экспрессия FOX-белков в эндометрии.

Обсуждение

Эндометриальная дисфункция остается значимой проблемой современной науки. В изученной литературе представлено множество причин, которые могут приводить к нарушению рецептивности слизистой оболочки тела матки, одной из которых считается недостаточная толщина эндометрия в преовуляторные дни [3, 9, 10]. Исследований, посвященных изучению рецептивности ТЭ, мало.

Возможной причиной формирования ТЭ и, как следствие, неполноценности его рецептивных свойств является эндотелиальная дисфункция, сопровождающаяся нарушениями микроциркуляции, в том числе на фоне повышенного содержания мужских половых гормонов в крови, ожирения (неспецифический системный воспалительный ответ за счет повышенной выработки провоспалительных цитокинов в жировой ткани), перенесенных инфекционных заболеваний [3, 7, 18].

Считается, что хронический эндометрит может быть причиной формирования нарушений рецептивных свойств эндометрия при различной толщине СОМ [19]. Для постановки данного диагноза необходимы гистологические и иммуногистохимические критерии: наличие плазматических клеток (CD138), фиброза стромы, склероза спиральных артерий, воспалительных инфильтратов в виде «лимфоидных фолликулов», располагающихся в базальном слое эндометрия и во всех отделах функционального слоя СОМ (должно быть 3 из 4 критериев с обязательным обнаружением CD138) [20]. В нашем исследовании у 114 женщин с репродуктивными неудачами в анамнезе не выявлено морфологических критериев диагноза «хронический эндометрит».

В литературе указано, что недостаток уровней Е₂, Р в периферической крови может быть предпосылкой формирования ТЭ и/или нарушений его рецептивности [3, 6]. У обследованных нами женщин с ТЭ отмечены нормальные уровни Е₂, Р и мужских половых гормонов в крови.

В целом у пациенток, включенных в наше исследование, не установлено очевидных причин формирования ТЭ и нарушения рецептивности слизистой тела матки. У них отмечены нормальные индекс массы тела и нормоэстрогенемия в крови, не выявлено диагноза «хронический эндометрит». Мы предположили, что репродуктивные неудачи могут быть связаны с дисбалансом ПМ как проявлением эндометриальной дисфункции.

Наиболее изученным остается посттравматическое нарушение рецептивности эндометрия вследствие выскабливания СОМ с возможным формированием фиброза и синехий и снижением гормонально-рецепторных взаимодействий в эндометрии [3, 19]. В нашей работе мы подтвердили данные о том, что 2 внутриматочных вмешательства и более (abrasio cavi uteri) являются предиктором нарушений рецептивности эндометрия, как это продемонстрировано в работах М.Р. Оразова и соавт. [3, 19]. Однако в соответствии с нашими данными, повторные выскабливания СОМ не ассоциированы с развитием такого феномена, как ТЭ, как это указано в некоторых литературных источниках [3].

По результатам проведенного корреляционного анализа продемонстрировано, что при нормоэстрогенемии и овуляторном значении Р (как в нашем исследовании) нет ассоциаций между уровнями E₂, Р в крови и величиной М-эхо, а также нет взаимосвязей между сывороточными уровнями половых стероидов и выраженностью эндометриальной экспрессии ER, PR, ЛИФ, FOX-белков. В то же время имеют место существенные положительные взаимосвязи между величиной М-эхо и выраженностью эндометриальной экспрессии FOXA2 (r=0,422; p<0,001), что косвенно может подтверждать важность данного маркера для процессов пролиферации эндометрия.

В литературе белок FOXA1 наиболее известен как фактор, значимый для развития рака молочной железы, рака простаты, онкологических процессов органов желудочно-кишечного тракта. В одном из исследований представлены результаты положительной корреляции экспрессии FOXA1 с избыточной пролиферацией клеток люминального эпителия при раке молочной железы [21]. Данных об изучении роли FOXA1 в процессах рецептивности эндометрия в доступной литературе не представлено. В нашем исследовании у здоровых женщин из группы контроля выявлена сниженная экспрессия FOXA1 в образцах эндометрия (6–8-й д.п.о.). Вероятно, важное значение имеет определенный необходимый уровень экспрессии FOXA1 для оптимальной (но не избыточной) активности процессов пролиферации в эстроген-чувствительных тканях. Характеристики экспрессии FOXA1 в слизистой тела матки (6–8-й д.п.о.) и их значение для эндометриальной рецептивности описаны нами впервые [22].

Белок FOXA2 является специфичным для СОМ маркером, однако данные о его влиянии в концепции рецептивности эндометрия немногочисленны. В доступной литературе есть исследования, в которых описано, что FOXA2 действует в эндометрии взаимозависимо с ЛИФ, участвуя в подготовке слизистой тела матки к возможной имплантации бластоцисты [23]. В нашем исследовании у женщин из группы контроля отмечена выраженная экспрессия FOXA2 в эндометрии (6–8-й д.п.о.). В основной группе с ТЭ 2/3 (71%) женщин имели характеристики экспрессии FOX-белков, отличные от здоровых женщин. Приведенные результаты экспрессии протеомных молекул описаны нами впервые [22].

В доступной литературе описаны условные пороговые значения счета ER, PR в эндометрии (максимальный счет – 300), которые могут быть значимы для эндометриальной экспрессии ПМ: для PR в железах – 105, для ER в железах – 145, для ER в строме – 155 [14]. При проведении логико-структурного анализа выявлено, что при счете PR в железах более 105 (6–8-й д.п.о.) риск сниженной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии и железах, отличной от здоровых женщин экспрессии FOXA1 и сниженной экспрессии FOXA2 в эндометрии выше, чем у женщин с низкой экспрессией PR в железах СОМ. При достаточных биологических эффектах прогестерона, которые максимально выражены в период «окна имплантации», экспрессия ER и PR должна снижаться, т.к. прогестерон тормозит экспрессию данных рецепторов. «Гиперэкспрессия» ER в железах эндометрия (H-score>145; 6–8-й д.п.о.) ассоциирована с более высоким риском отличной от здоровых женщин экспрессии ПМ (ЛИФ в люминальном эпителии, железах и строме, FOXA1, FOXA2), чем при счете ER в эндометриальных железах менее 145. При экспрессии ER в строме эндометрия более 155 был выше риск сниженной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии, железах и строме, а также риск повышенной (отличной от здоровых женщин) FOXA1 в эндометрии и риск сниженной экспрессии FOXA2, чем при экспрессии ER в строме менее 155. Такие условные пороговые значения счета эндометриальных ER, PR, важные для экспрессии ЛИФ, FOX-белков, описаны нами впервые.

В изученной литературе нет данных о роли отдельных ПМ, которые могут быть предикторами успешного лечения препаратами экзогенного эстрадиола у женщин с исходным ТЭ. Безусловно, терапия препаратами эстрадиола у пациенток с «тонкой» СОМ является эмпирической. По результатам нашей работы продемонстрировано, что лучший эффект терапии препаратами эстрадиола в обычных дозах (1–1,5 мг/сут) и/или наступление беременности при наличии ТЭ наблюдали у женщин с нарушениями фертильности в анамнезе, у которых эндометриальная экспрессия ER, PR, ЛИФ, FOX-белков сходна со здоровыми женщинами. Значимое увеличение М-эхо при использовании увеличенных доз препаратов эстрадиола (4 мг/сут) можно ожидать у женщин с ТЭ при различных вариантах гормонально-рецепторных взаимодействий в слизистой тела матки, при условии, что экспрессия ЛИФ, FOX-белков у них будет сходна со здоровыми женщинами [15]. Спонтанная беременность у женщин с ТЭ наступила в 5 лучаях в нашей работе, что согласуется с исследованиями P. Sundström [16] и J. Check и соавт. [17]. По нашим немногочисленным в настоящий момент наблюдениям у всех участниц эндометриальная экспрессия FOXA1 и/или FOXA2 являлась сходной со здоровыми женщинами, при этом характеристики экспрессии ER, PR, ЛИФ в эндометрии отличались от группы контроля. Приведенные результаты описаны впервые.

В настоящее время не существует специфических методов по улучшению экспрессии ПМ в эндометрии, в том числе при его недостаточной толщине. Поиск эффективных методов улучшения рецептивности слизистой оболочки тела матки является актуальной задачей современной науки.

Заключение

Сочетанное гистологическое и иммуногистохимическое исследование образцов эндометрия позволяет оценить основные характеристики рецептивности ТЭ при анамнезе репродуктивных неудач неясного генеза. Величина М-эхо не является единственным предиктором дисбаланса ПМ рецептивности, однако наличие ТЭ предопределяет бόльшую вероятность нарушений эндометриальной экспрессии ER, PR, ЛИФ, FOX-белков.

Выраженность экспрессии FOX-белков в эндометрии и полноценность гормонально-рецепторных взаимодействий в слизистой тела матки могут являться прогностическими маркерами эффективности применения препаратов экзогенного эстрадиола у женщин с ТЭ и репродуктивными нарушениями в анамнезе для усиления пролиферации гипопластической СОМ.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Информированное согласие на публикацию. Пациенты подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом кафедры акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» (протокол №8 от 11.11.2020). Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской конвенции.

Ethics approval. The study was approved by the local ethics committee of Department of Obstetrics and Gynecology of Mechnikov North-Western State Medical University (No. 8 dated November 11, 2020). The approval and procedure for the protocol were obtained in accordance with the principles of the Helsinki Convention.

Об авторах

Наталия Владимировна Аганезова

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: aganezova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9676-1570
SPIN-код: 2961-5377

д-р мед. наук, доц., проф. каф. акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова»

Россия, Санкт-Петербург

Сергей Станиславович Аганезов

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России

Email: aganezov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3523-9922
SPIN-код: 8186-6778

канд. мед. наук, доц., доц. каф. акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова»

Россия, Санкт-Петербург

Ксения Эдуардовна Гогичашвили

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России

Email: kseniagogichashvili@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5430-7118
SPIN-код: 8683-2954

аспирант каф. акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова»

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы