Vaginal infections in pregnant women: diagnosis, new paradigms of therapy. A prospective study

Full Text

В условиях демографической нестабильности в Российской Федерации одной из ключевых задач отечественного здравоохранения является охрана репродуктивного здоровья женщин. Снижение рождаемости, наблюдаемое в последние годы, вызвано различными социальными, экономическими и медицинскими причинами. Среди последних особое место занимают бесплодие, невынашивание беременности, преждевременные роды, внутриутробное инфицирование плода. Значимый процент репродуктивных неудач (30–40%) связан с воспалительными заболеваниями нижних отделов половых путей женщины [1].

Известно, что вагинальное здоровье является важным фактором женской репродукции и во многом определяет наступление, течение и исходы беременности. Хотя в последние десятилетия накоплено немало данных, касающихся теоретических и прикладных вопросов общей микробиологии, в понимании вагинального здоровья остается много нерешенных проблем. В частности, требуют дальнейшего изучения факторы, определяющие микробный состав вагинального биотопа и механизмы его взаимодействия с организмом хозяина. Особую актуальность приведенная проблема приобретает в тех случаях, когда речь идет о беременной женщине [2].

В свете современных знаний не вызывает сомнения тот факт, что лактобациллярная флора является оптимальной для влагалищного биотопа в любом периоде жизни женщины, а также во время беременности. Лактобактерии – грамположительные анаэробные неспорообразующие бактерии, один из самых многочисленных родов. Во влагалище они представлены несколькими доминирующими видами: Lactobacillus crispatus, Lactobacillus iners, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus jensenii и др. Важной функцией лактобактерий считается их протективный эффект во влагалище, цервикальном канале и полости матки. Лактобактерии продуцируют метаболиты, необходимые для подавления патогенных микроорганизмов, повышают вязкость слизи, конкурентно исключают адгезию патогенов к эпителию, параллельно способны модерировать местный иммунитет и регулировать воспаление. Вместе с тем избыточная колонизация лактобактерий может приводить к повреждению эпителия в связи с резким снижением рН влагалищной среды, а доминирование во влагалищном биотопе некоторых штаммов, например: L. crispatus, L. acidophilus, L.helveticus и L. gasseri, способно негативно повлиять на подвижность сперматозоидов, прикрепляясь к их поверхности, тем самым препятствуя оплодотворению [3, 4]. Роль других микроорганизмов, например факультативно-анаэробных бактерий и прокариотических вирусов (бактериофагов), широко представленных в вагинальной среде, также весьма велика. За счет стимулирующего воздействия комменсалов на мукозальный иммунитет – главный гарант стабильности влагалищного биотопа, они обеспечивают тот баланс микробного разнообразия, который требуется для устойчивого равновесия системы [5].

Разнообразие вагинальных микробных сообществ с недавних пор принято сортировать на основе иерархической кластеризации, что облегчает трактовку полученных данных и позволяет стандартизировать вагинальную микробиоту. Кластерный анализ делит ее на 5 типов бактериальных сообществ (CST), 4 из которых характеризуются преобладанием определенных видов Lactobacillus: CST I – L. crispatus, CST II – L. gasseri, CST III – L. iners, CST V – L. jensenii. Напротив, кластер CST IV отличается низким содержанием Lactobacillus spp. и чрезмерным представительством анаэробных бактерий, таких как Atopobium, Prevotella, Sneathia, Gardnerella и Mobiliuncus [6].

Во время беременности вагинальная микробиота имеет свои отличительные особенности, продиктованные необходимостью максимальной защиты матери и внутриутробного плода от воздействия негативных инфекционных факторов. Инфекция, в том числе вагинальная, считается причиной 15% ранних и 66% поздних выкидышей, а также 40% случаев преждевременных родов [7]. Важнейшей защитной реакцией при гестации является адаптация микробиоты влагалища, которая заключается в постепенном снижении микробного разнообразия, абсолютном преобладании лактобактерий и обеспечении большой устойчивости. Примечательно, что данный процесс намного более выражен у женщин африканского и латиноамериканского происхождения, т.к. исходное разнообразие флоры у них значительно выше, а итоговый статус в конце беременности не отличается от такового у представительниц европеоидного и азиатского этносов [8].

Во влагалище здоровой беременной доминируют L. crispatus, L. gasseri и L. jensenii при более низкой распространенности остальных филотипов. Тип CST IV, характеризующийся присутствием таксонов, связанных с бактериальным вагинозом (БВ), встречается значительно реже. Интересно, что L. iners, часто персистирующая в условиях БВ, может присутствовать у беременных, не имеющих признаков вагинальной инфекции. Стабильность биотопа во время гестации обусловлена, скорее всего, относительно высоким уровнем эстрогенов. Подтверждением этому служит резкий сдвиг в сторону менее доминирующих сообществ Lactobacillus spp. с повышенным α-разнообразием в послеродовом периоде [9]. В процессе ремоделирования вагинального биотопа на всем протяжении беременности в него вовлекаются не только бактерии, но и иные представители микробного мира – вирусы, грибы, археи. При этом вирусное сообщество тесно связано с бактериальным, а бактериофаги играют значительную, хотя и неоднозначную роль в микробиоме. Установлено, что у беременных с вагинитом в микробных ассоциациях часто присутствуют вирусы семейства Anelloviridae, а также различные типы вируса папилломы человека [10].

Известно, что ремоделирование микробиома во время беременности касается не только половых путей, но и других биологических ниш, в частности кишечника, ротовой полости, мочевой системы. Доказательством этого стали результаты исследования Multi-Omic Microbiome Study: Pregnancy Initiative (MOMS-PI). В него вошли 1527 беременных женщин с 206 437 образцами, которые включали вагинальные, ректальные, буккальные, кожные и назальные мазки матери, мочу и кровь беременных, пуповину, пуповинную кровь, меконий, ректальные, кожные и буккальные мазки новорожденных [11].

Интерес вызывают данные о том, что независимо от характера вагинальной микробиоты в начале беременности уже ко II триместру наблюдается ее стабилизация с доминированием лактобациллярного эубиоза [12], что заставляет пересмотреть механистические подходы, когда любое отклонение в микробиологическом статусе влагалища у женщины на ранних сроках беременности трактуется как патология и подлежит обязательной коррекции. По-видимому, необходимы персонифицированные диагностические и лечебные решения для того, чтобы избегать неоправданной фармакологической агрессии. В то же время тезис о необходимости лечения вагинальных инфекций не подлежит пересмотру. Состояние вагинального биотопа требует безотлагательной оценки при обращении пациентки по поводу беременности. В соответствии с действующими клиническими рекомендациями Минздрава России «Нормальная беременность» (2024 г.) [13] при первом визите беременной необходимо исключить у нее наличие ВИЧ, гепатитов (В и С), сифилиса серологическими методами, а гонорею и трихомониаз – с помощью микроскопического исследования влагалищных мазков. Вместе с тем проведение рутинного молекулярно-биологического тестирования для выявления у асимптомных пациенток возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, а также определения ДНК Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae и условно-патогенных генитальных микоплазм клинически и экономически нецелесообразно. Данные тесты могут потребоваться только при появлении жалоб на вагинальный дискомфорт, изменение характера выделений из половых путей, зуд, жжение, запах, а также при воспалительном характере влагалищных мазков.

Микроскопическое исследование отделяемого женских половых органов у беременных женщин является обязательным. Приведенный простой, низкозатратный и быстрый метод позволяет визуализировать дрожжевые клетки, псевдомицелий грибов, морфологический состав микрофлоры и соотношение бактериальных морфотипов, а также характер эпителия, «ключевые клетки» и степень локального воспаления. Однако для выбора лечения результаты микроскопии всегда должны соотноситься с объективными симптомами и жалобами пациентки. Нужно отметить, что противоположная тактика, такая как эмпирическое лечение, основанное только на анамнезе и физикальном обследовании, по нашему мнению, а также по данным зарубежных авторов, является ошибочной. В недавно опубликованном исследовании, в котором приняли участие более 300 женщин с симптомами вагинальной инфекции, показано, что практически каждая вторая (47%) пациентка получила в подобной ситуации одно или несколько несоответствующих назначений и имела повторные проблемы в течение 90 дней [14].

Еще один распространенный диагностический тест – бактериологический анализ вагинального отделяемого, который также не рекомендуется выполнять у беременных рутинно. Согласно клиническим рекомендациям он должен использоваться как альтернатива методу полимеразной цепной реакции на сроке 35–37 нед исключительно с целью идентификации стрептококка группы В (Streptococcus agalactiae) для обоснования необходимости последующей интранатальной профилактики инфицирования плода. Вместе с тем следует обратить внимание на то, что, согласно проекту клинических рекомендаций «Воспалительные болезни шейки матки, влагалища и вульвы» от 2024 г., бактериологический метод может быть полезен у беременных при рецидивирующем течении кандидоза вульвы и влагалища или аэробного вагинита для определения характера возбудителей и их чувствительности к лекарственным препаратам (ЛП) [15].

К сожалению, в клинической практике бактериологическое исследование до сих пор часто выполняют без всяких показаний в I триместре беременности у бессимптомных женщин, что нередко влечет неоправданное назначение антибактериальных препаратов. Об этом свидетельствуют полученные нами данные анализа 145 амбулаторных карт женщин, наблюдавшихся по поводу беременности. Установлено, что 41% из них в отсутствие какой-либо клинической симптоматики и четко сформулированного диагноза проводили санацию влагалища исключительно на основании результатов бактериологического исследования или микроскопии вагинальных мазков. В то же время не вызывает сомнения, что подтвержденные инфекционные процессы во влагалище у беременных женщин требуют безотлагательного лечения. Большое значение имеет рациональный выбор препарата для лечения, к которому предъявляются требования высокой эффективности и безопасности для матери и плода.

Цель исследования – оценка эффективности новой лекарственной формы бензилдиметил [3-(миристоиламино) пропил] аммоний хлорид моногидрата (Мирамистин®) 15 мг/сут в виде суппозиториев вагинальных (регистрационный номер ЛП-008114 от 28 апреля 2022 г.) при вульвовагинальной инфекции (ВВИ) у беременных женщин.

Материалы и методы

Обследованы и получили лечение 60 пациенток, наблюдавшихся по беременности в женских консультациях и клинико-диагностических отделениях г. Москвы и Казани. Поводом для детального обследования стали жалобы 38 (63,3%) пациенток на рецидивирующие патологические выделения из половых путей, 27 (45%) – на диспареунию, 39 (65%) – на зуд и жжение в области наружных половых органов. При микроскопическом исследовании отделяемого женских половых органов у 76,6% беременных обнаружен лейкоцитоз >30–40 в п/зр. На основании специфичных жалоб (выделений, запаха, зуда, жжения и других симптомов) и путем выявления визуальных клинических признаков, характерных для инфекционных процессов во влагалище, а также полученных результатов лабораторного тестирования у всех обследованных диагностированы ВВИ. По факту описанных клинических симптомов вагинита и результатов микроскопии влагалищных мазков, рН-метрии вагинального содержимого, данных исследования микробиоты с помощью системы Фемофлор 16, в совокупности подтверждающих наличие локального воспалительного процесса (ВП), беременным женщинам назначено лечение бензилдиметил [3-(миристоиламино) пропил] аммоний хлорид моногидратом 15 мг/сут в виде суппозиториев вагинальных в течение 7 дней*. При фоновом обследовании и в динамике лечения на каждую пациентку заполняли дополнительную, специально разработанную документацию (анкету), данные из которой в последующем использованы для статистического анализа.

Все выполняемые медицинские исследования и процедуры в рамках проведения исследования были рутинными, используемыми в повседневной клинической практике, что определило неинтервенционный (наблюдательный) характер исследования. Пациентки, включенные в исследование, самостоятельно подписали добровольное информированное согласие на передачу и обработку своих персональных данных. Динамику симптомов беременные оценивали самостоятельно в процессе лечения и через 30 дней после его окончания на основании Визуальной аналоговой шкалы. Эффективность лечения оценивали исходя из динамики клинических симптомов, результатов исследования вагинальных мазков по Граму и микробиоты влагалища с помощью системы Фемофлор 16 до и после курса лечения. Безопасность терапии оценивали по анализу всех нежелательных явлений (НЯ) и серьезных НЯ (СНЯ), начиная с момента подписания участницами информированного согласия и до момента окончания исследования. Оценку удовлетворенности врача терапевтическим эффектом препарата Мирамистин® и общий клинический ответ учитывали путем заполнения врачом опросника – шкалы Лайкерта – на визите завершения участия в программе.

Статистическую обработку данных производили с использованием программного обеспечения SPSS Statistica v. 26 (IBM, США) и JMP Pro 17 (SAS, США). Качественные признаки представлены в виде долей и частот выявления признака (%). Уровень значимости при проверке статистических гипотез зафиксирован при p<0,05.

Результаты

Проведенное исследование показало, что у 90% обследованных беременных женщин ВП во влагалище поддерживался комбинацией 3 и более возбудителей, среди которых доминировали облигатно-анаэробные микроорганизмы семейств Enterobacteriaceae, Eubacterium spp. Дефицит лактобактерий, как относительный, так и абсолютный, выявлен у каждой второй беременной (табл. 1, рис. 1).

 

Таблица 1. Результаты исследования микробиоты с помощью системы Фемофлор 16 у пациенток в I триместре беременности до и после лечения препаратом Мирамистин® 15 мг в виде вагинальных суппозиториев (n=60) Table 1. Results of microbiota study using Femoflor 16 system in patients in the first trimester of pregnancy before treatment and after therapy with Miramistin® 15 mg in the form of vaginal suppositories (n=60).
Микроорганизмы, выявленные в количестве 106–107 lg/KOE отделяемого женских половых органов	Группа исследования		p
	до лечения	после лечения
Lactobacillus spp., L. crispatus и др.	15	56	<0,001
Семейство Enterobacteriaceae	24	6	<0,001
Streptococcus spp.	25	3	<0,001
Staphylococcus spp.	16	0	<0,001
Облигатно-анаэробные микроорганизмы
G. vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp.	41	8	<0,001
Eubacterium spp.	35	6	< 0,001
Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp.	10	1	<0,006
Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp.	8	0	<0,004
Lachnobacterium spp./Clostridium spp.	9	1	<0,010
Mobiluncus spp./Corinebacterium spp.	12	2	< 0,006
Peptostreptococcus spp.	13	2	<0,004
A. vaginae	15	2	<0,001
Дрожжеподобные грибы
Candida spp.	13	1	<0,017
Примечание. Статистически значимые отличия между группами p<0,05.

 

Рис. 1. Анаэробный дисбиоз у беременной с вагинитом (до лечения).

Fig. 1. Anaerobic dysbiosis in a pregnant woman with vaginitis (pre-treatment).

 

По данным Визуальной аналоговой шкалы у большинства (96,7%) пациенток в течение первых 2 сут от начала лечения отмечено исчезновение или значительное уменьшение основных клинических симптомов ВВИ, что в среднем на 3–4 дня раньше, чем факт микробиологической деконтаминации. Сравнительный анализ жалоб и результатов исследований с помощью системы Фемофлор 16, проведенный через 30 дней после завершения курса лечения препаратом Мирамистин® (см. табл. 1), продемонстрировал общую положительную динамику, причем даже при наличии условного нормоциноза (рис. 2, 3). Патологические выделения не возобновлялись, а общая продолжительность безрецидивного временного интервала составила более 4 нед.

 

Рис. 2. Абсолютный нормоциноз у беременной после лечения.

Fig. 2. Absolute normocinosis in a pregnant woman after treatment.

 

Рис. 3. Условный нормоциноз у беременной после лечения.

Fig. 3. Conditional normocinosis in a pregnant woman after treatment.

 

Соответственно, эффективность проводимой комплексной терапии составила 96,7%. Применение бензилдиметил [3-(миристоиламино) пропил] аммоний хлорид моногидрата 15 мг/сут в виде суппозиториев вагинальных не сопровождалось развитием НЯ или отказом от продолжения лечения в 100% наблюдений. В целом удовлетворенность врача клиническим ответом на лечение была достоверно выше, чем удовлетворенность пациенток удобством применения препарата (средний балл по Лайкерту – 4,39±0,5 и 4,07±0,8 соответственно).

Обсуждение

Проведенное исследование подтвердило, что ВП во влагалище во время беременности с высокой долей вероятности (90%) поддерживается комбинацией возбудителей. При смешанном вагините, наряду с типичными жалобами (обильными выделениями, жжением, зудом) и характерными клиническими проявлениями ВП (гиперемией, отеком слизистой, выделениями), отмечаются преобладание лейкоцитов над эпителиальными клетками, частое присутствие ключевых клеток, повышение значений рН влагалища. При секвенировании обнаруживаются и аэробные, и анаэробные микроорганизмы. В подобной ситуации прослеживается универсальный патогенетический сценарий. Спровоцированное анаэробами повреждение эпителия сопровождается рекрутированием иммунных клеток, которые производят провоспалительные цитокины и хемокины. Образующийся на этом этапе активный кислород выходит за пределы эпителия. Происходит смена биотопа – лактобактерии и анаэробы подавляются, а аэробная флора приобретает конкурентные преимущества, что способствует ее активному размножению [16, 17]. В микробные ассоциации могут встраиваться грибы рода Candida, и тогда, при всей внешней схожести симптомов с вульво-вагинальным кандидозом, терапевтические подходы будут иметь иную направленность. Таргетная терапия антикандидозными препаратами не сможет обеспечить устойчивый эффект, т.к. не будет контролировать анаэробную и аэробную составляющие микробиоты. Результаты лечения будут неполными и кратковременными. Клиническая практика показывает, что смешанные вагиниты характеризуются длительным и упорным течением, высокой частотой рецидивов, яркой симптоматикой, в целом негативным влиянием на течение беременности (угрозой прерывания, истмико-цервикальной недостаточностью, внутриутробным инфицированием плода, послеродовыми воспалительными осложнениями и др.).

Соответственно, наиболее актуальным является вопрос рационального выбора тех ЛП, которые способны воздействовать на вероятные причинно-значимые патогены. Важность индивидуализации терапии с учетом клинической формы заболевания многократно возрастает у беременных женщин, учитывая ограниченный выбор разрешенных во время беременности ЛП. Неудовлетворенность результатами супрессивной терапии побуждает к изменению схем лечения или поиску его альтернативных вариантов. Традиционные для России схемы двухэтапной терапии неспецифических вагинитов и БВ формируют новые подходы к лечению рецидивирующей микст-инфекции у беременных и должны отличаться от стандартной супрессивной терапии, эффективность которой ограничивается спектром действия антибиотиков, их переносимостью и формированием микробной резистентности.

Новой парадигмой в лечении вагинальных инфекций стали современные антибактериальные препараты широкого спектра действия. К их числу относятся не только антибиотики, но и антисептики, применение которых в последние годы оказывается все более популярным [18]. По нашему мнению, такой подход к лечению ВВИ представляется разумной альтернативой длительному приему антибиотиков.

Помимо удобства применения, хорошей переносимости, минимальной системной абсорбции антисептические средства обладают рядом важных преимуществ. Во-первых, им присуще полипотентное действие в отношении практически всех патогенов, способных нарушить нормоценоз влагалищного биотопа. Во-вторых, по сравнению с антибиотиками, для современных антисептиков характерна меньшая вероятность развития приобретенной полимикробной резистентности из-за неспособности возбудителей вырабатывать к ним устойчивость, что обусловлено универсальным принципом действия антисептических средств, в основе которого лежат денатурация белков патогенных микроорганизмов, критическое окисление компонентов клеточной стенки и, как результат, дегидратация и гибель возбудителя. Данный механизм расценивается как особенно важный при лечении рецидивирующих вагинальных инфекций [19].

Проведенное нами исследование показало, что перечисленными свойствами в полной мере обладает бензилдиметил [3-(миристоиламино) пропил] аммоний хлорид моногидрат, известный в клинической практике как Мирамистин®. Спектр его бактерицидного действия распространяется на грамположительные (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Streptococcus pneumoniae) и грамотрицательные (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella spp.), аэробные и анаэробные бактерии, включая их ассоциации, а также на госпитальные резистентные штаммы. Бензилдиметил [3-(миристоиламино) пропил] аммоний хлорид моногидрат активен в отношении дрожжеподобных грибов (C. albicans, C. tropicalis, Candida krusei и других), возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (Chlamydia spp., Treponema spp., Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae), а также в отношении сложноустроенных вирусов (герпеса, иммунодефицита человека). Доказано, что молекула бензилдиметил [3-(миристоиламино) пропил] аммоний хлорид моногидрата обладает способностью вызывать солюбилизацию мембранных белков клеточной стенки патогенов, в результате чего происходят гипергидроз и цитолиз микроорганизма. Приведенный процесс носит одномоментный и необратимый характер, не оставляя патогену возможности формировать любые способы резистентности [20].

Появление новой лекарственной формы препарата Мирамистин® в виде вагинальных суппозиториев существенно расширило возможности применения препарата в качестве средства стартовой терапии при вагинальной инфекции смешанного генеза в гинекологической практике, а также на любом сроке беременности, в том числе и в I триместре, когда выбор препаратов значительно ограничен. Следует подчеркнуть, что с позиции улучшения акушерских и перинатальных исходов коррекцию состава вагинальной микробиоты, включая БВ-ассоциированные бактерии и аэробную микрофлору, кроме В-стрептококков, перед родами можно проводить с помощью антисептиков. Такой подход оправдан с позиции не только рациональной профилактики инфекционных послеродовых осложнений, но и интранатального инфицирования плода при минимизации негативного влияния ЛП на здоровье матери и новорожденного [21].

Заключение

Таким образом, понимание того, что патогенетической основой вагинальных инфекций является формирование полимикробных сообществ, включающих различные виды условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, а не избыточная колонизация половых путей одним представителем влагалищной микробиоты, формирует новые подходы к терапии. Они сводятся к использованию средств широкого спектра действия, причем не только антибиотиков, но и антисептиков, которые являются хорошим ресурсом эффективного лечения и предупреждения рецидивов инфекционных процессов во влагалище, что имеет особое значение во время беременности.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Информированное согласие на публикацию. Пациентки подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patient for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

*Мирамистин®. Инструкция по медицинскому применению лекарственного препарата. Регистрационный номер ЛП-008114 от 28 апреля 2022 г.

About the authors

Natalia M. Podzolkova

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education; Botkin Moscow Multidisciplinary Scientific and Clinical Center

Email: tzefirova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8991-1369

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Moscow; Moscow

Tatiana P. Zefirova

Kazan State Medical Academy – branch of Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Author for correspondence.
Email: tzefirova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6785-6063

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Kazan

Larisa G. Sozaeva

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: tzefirova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1793-5684

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Dina A. Sadykova

Kazan State Medical Academy – branch of Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: tzefirova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0177-5137

Graduate Student

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files