Preservation of reproductive material using the in vitro maturation method in patients with oncological diseases

Full Text

Введение

Обеспечение улучшения качества жизни онкологических пациентов является одной из приоритетных задач в медицинской практике. В последние десятилетия существенно возросла эффективность ранней диагностики и новых методов лечения онкологических заболеваний, что привело к улучшению исходов и увеличению выживаемости пациентов. В 2019 г. в Российской Федерации выявлено 348 894 новых случая онкологических заболеваний у пациентов женского пола. Из них 5,8% встречаются до 40 лет. Наиболее распространенными онкологическими патологиями у женщин репродуктивного периода, по данным Всемирной организации здравоохранения, являются рак молочной железы – РМЖ (24,4%), рак эндометрия (9,3%), рак шейки матки (5%) и другие виды рака (43%) [1, 2]. При этом не менее чем в 20% случаев рак возникает у женщин, не реализовавших свою репродуктивную функцию [3]. Важной проблемой является гонадотоксичность проводимого лечения у данной группы больных, которая приводит к ятрогенной преждевременной недостаточности яичников, что повышает спрос на возможности сохранения своей репродуктивной функции. Американское общество клинической онкологии рекомендует обсуждение с пациентками возможности сохранения фертильности и направление в клинику репродуктивного здоровья. При этом лечение рака имеет первостепенное значение [3–6]. В связи с этим актуальным представляется поиск и решение проблемы сохранения фертильности у данных пациенток.

Существенной проблемой при РМЖ является высокая экспрессия рецепторов к эстрогенам (ER). В связи с этим таким пациенткам нежелательна процедура овариальной стимуляции с последующим получением репродуктивного материала. Для решения этой проблемы может быть использован метод in vitro maturation (IVM), который помогает избежать повышения уровня эстрадиола и последующего вреда для организма онкологических больных [7].

Метод созревания ооцитов IVM зарекомендовал себя как вспомогательная репродуктивная технология (ВРТ) с высоким коэффициентом живорождаемости [8]. Данный способ имеет длинную историю и до 2021 г. считался экспериментальным. Однако в последних гайдлайнах Американского комитета клинической онкологии, Американского общества репродуктивной медицины, а также Общества репродуктивных биологов и технологов и Общества вспомогательных репродуктивных технологий приведены аргументы в пользу безопасности IVM и данную технологию рекомендовано убрать из рубрики экспериментальной [9, 10].

IVM представляет собой созревание незрелых комплексов ооцит-кумулюс (КОК) от стадии профазы I (стадия зародышевого пузырька GV) через мейоз I до достижения метафазы II (MII) после получения из фолликулов, не подвергшихся воздействию преовуляторного триггера (КОК представлены на рис. 1) [9, 11]. Данная методика состоит из двух этапов: I – сбор КОК от не/минимально стимулированных яичников, II – созревание ооцитов до стадии MII. Для созревания ооцитов от GV до MII обычно необходимо 36–48 ч культивирования in vitro, а от стадии метафазы I (MI) до MII – 6–24 ч [12].

 

Рис. 1: а – КОК, содержащий зародышевый пузырек; b – ооцит в состоянии МII (адаптировано [10]); линейная шкала: 50 мкм.

Fig. 1: a – oocyte-cumulus complex containing an embryonic vesicle; b – oocyte in the state of metaphase II (adapted [10]); linear scale: 50 microns.

 

По данным мировой литературы, существенных различий между результатами забора в разные фазы менструального цикла не выявлено [13]. Применение данной методики возможно как с применением трансвагинальной пункции (ТВП), так и непосредственно из удаленной ткани яичника – IVM ex vivo. У онкологических пациентов, по данным H. Creux и соавт., показатели созревания яйцеклеток составляют 79%, а клинические показатели беременности – 18–30% при переносе эмбриона, полученного при помощи IVM [14].

Цель исследования – оценить количество и качество ооцитов, полученных путем IVM, на малой выборке пациентов.

Материалы и методы

В нашей клинике проведено проспективное исследование с участием 5 женщин репродуктивного периода с верифицированным онкологическим заболеванием до проведения химиотерапевтического лечения. Данное исследование одобрено локальным этическим комитетом. Все пациентки перед проведением процедуры IVM проинформированы о рисках, а также возможных исходах и неудачах. Также ими подписано информированное добровольное согласие.

Критериями включения в данное исследование явились возраст пациенток от 18 до 42 лет, верифицированный диагноз РМЖ, отсутствие ранее проведенных курсов химиотерапии, уровень антимюллерового гормона (АМГ) >1 нг/мл, количество антральных фолликулов (КАФ) по данным трансвагинального ультразвукового исследования (УЗИ) более 5 в обоих яичниках суммарно.

Все пациентки полностью обследованы в соответствии с приказом №803н от 31.07.2020 «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». Проведены исследование гормонального профиля, включая уровень АМГ, трансвагинальное УЗИ с оценкой КАФ, маммография или УЗИ молочных желез в зависимости от возраста пациенток. Все пациентки консультированы врачом-онкологом, химиотерапевтом, радиологом, психологом и генетиком.

В отделении ВРТ 3 пациенткам проводили ТВП яичников без предварительной гормональной стимуляции, еще у 2 пациенток пунктировали фолликулы уже удаленной ткани яичника. Полученную в ходе пункции фолликулярную жидкость исследовали в эмбриологической лаборатории под стереомикроскопом на предмет наличия или отсутствия КОК. Извлеченную ткань яичника помещали в контейнер для биоматериала, наполненный 0,9% раствором NaCl, и транспортировали на льду в эмбриологическую лабораторию отделения ВРТ в течение 90 мин. В лаборатории аспирировали все видимые антральные фолликулы с применением инъекционной иглы (21G), присоединенной к шприцу (5 мл). Фолликулярную жидкость помещали в чашку Петри и оценивали под стереомикроскопом на наличие ооцит-кумулюсных комплексов. После этого при помощи хирургических скальпелей отделяли корковый слой яичника от мозгового, а среду (G-MOPS), в которой проводились манипуляции, оценивали на наличие КОК. G-MOPS – это специальная среда, разработанная для обработки и манипуляций с ооцитами, содержащая человеческий сывороточный альбумин.

Все полученные КОК культивировали в 4-луночных планшетах в среде для дозревания (IVM) с добавлением 0,75 МЕ/мл фоллитропина α, 1 МЕ/мл хорионического гонадотропина человека и 10 мг/мл сывороточного альбумина человека при 37°С в атмосфере 7% СО₂ и 5% О₂. Через 28 ч культивирования КОК помещали в 80 ЕД/мл раствор гиалуронидазы и пипетированием удаляли кумулюсные клетки. Зрелость яйцеклеток оценивали по морфологическим признакам, все незрелые ооциты культивировали в среде для дозревания еще 24 ч. Зрелые яйцеклетки оплодотворяли методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида спермой партнера при наличии информированного добровольного согласия пациентки. Полученные эмбрионы культивировали в среде GTL (специальная среда для непрерывной культуры в инкубаторе) при 37°С в атмосфере 7% СО₂ и 5% О₂ в течение 5–6 сут. Качество эмбрионов оценивали на 3, 5 и 6-й дни культивирования.

Результаты

Из онкологического отделения для рассмотрения вопроса о возможности сохранения репродуктивного материала направлены 5 пациенток с РМЖ. Из табл. 1 видно, что у всех пациенток определяется большое количество ER, в связи с чем пациенткам не рекомендовано проведение гормональной стимуляции яичников. Стоит отметить, что больные находились на разных стадиях лечения: 2 пациенткам на момент осмотра репродуктологом уже проведена радикальная подкожная мастэктомия, 2 пациентки готовились к прохождению неоадъювантной химиотерапии. Еще 1 пациентка готовилась к комбинированному оперативному лечению по поводу РМЖ и удалению образования левого яичника, ей предложено проведение IVM ex vivo.

 

Таблица 1. Данные направленных пациенток с РМЖ

Table 1. Data from referred breast cancer patients

	Пациентка 1	Пациентка 2	Пациентка 3	Пациентка 4	Пациентка 5
Диагноз	Рак левой молочной железы T1aN0M0, Ia стадия, люминальный В тип, Her-негативный	Рак правой молочной железы T2N0M0, IIa стадия, люминальный В тип, Her-негативный	Рак левой молочной железы T1N0M0, Ia стадия, люминальный A тип, Her-негативный	Рак правой молочной железы T2N0M0, Ia стадия, люминальный В тип, Her-негативный	Рак правой молочной железы T1cN0M0, Ia стадия, люминальный В тип, Her-негативный. Носитель BRCA I. Образование левого яичника
Гистологическое заключение	Неспецифическая инвазивная карцинома G2	Инвазивный РМЖ без признаков специфичности, G2, участки рака in situ high nuclear grade	Неспецифическая инвазивная карцинома G1	Неспецифическая инвазивная карцинома G2	Неспецифическая инвазивная карцинома G3
Иммуногистохимия	ER 5, PR 6, Ki 67 – 25%, Her – 1+	ER 8, PR 7, Ki 67 – 30%, Her – 1+	ER 7, PR 8, Ki 67 – 10%, Her – 0	ER 8, PR 8, Ki 67 – 25%, Her – 1+	ER 7, PR 6, Ki 67 – 35%, Her – 1+

Примечание. PR – рецепторы прогестерона.

 

Возраст пациенток указан в табл. 2. Обращает на себя внимание тот факт, что самой молодой пациентке на момент осмотра 34 года, однако репродуктивная функция у всех исследуемых еще не реализована. Всем пациенткам перед проведением пункции фолликулов выполнено УЗИ малого таза с оценкой КАФ. У 1 из пациенток перед проведением IVM выявлены мультифолликулярные яичники с КАФ>20 в каждом яичнике. Также исследован уровень АМГ у всех пациенток для оценки овариального резерва. Полученные данные представлены в табл. 2. Как видно из таблицы, отмечена корреляция между уровнем АМГ и КАФ.

 

Таблица 2. Результаты оценки уровня АМГ и КАФ

Table 2. Results of evaluation of the level of anti-muller hormone and the number of antral follicles

	Пациентка 1	Пациентка 2	Пациентка 3	Пациентка 4	Пациентка 5
Возраст	37	35	36	34	38
АМГ, нг/мл	1,02	1,27	1,41	1,78	1,13
КАФ	5–6 в левом яичнике	6–7 в левом яичнике	8–9 в левом яичнике	>20 в обоих яичниках	5–6 в левом яичнике
	6–7 в правом яичнике	7–8 в правом яичнике	8–9 в правом яичнике		5–6 в правом яичнике

 

Среднее время от обращения пациентки к репродуктологу до проведения процедуры IVM составило 4–5 дней.

Четырем пациенткам выполнена ТВП фолликулов с получением фолликулярной жидкости, содержащей КОК.

В лаборатории эмбриологии исследовали фолликулярную жидкость и извлекали из нее КОК. Процесс извлечения изображен на рис. 2. У каждой пациентки получено разное количество КОК в зависимости от исходного уровня АМГ и КАФ. Следует отметить, что у пациентки с КАФ>20 в каждом яичнике получено 22 КОК, что подтверждает взаимосвязь между уровнем КАФ и количеством получаемых КОК. Полученные результаты представлены в табл. 3. Из всех ооцитов 9 дегенерировали, остальные культивировали в течение 28 ч. У пациенток 2, 3 целью стало криоконсервировать полученные ооциты, для пациенток 1, 4 дополнительно проводили оплодотворение методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида. Всего оплодотворено 13 ооцитов, из них получено 6 эмбрионов. Два эмбриона остановились в развитии, не витрифицированы, остальные эмбрионы, достигнув стадии бластоцисты, криоконсервированы.

 

Рис. 2. Извлечение ооцитов из фолликулярной жидкости.

Fig. 2. Extraction of oocytes from follicular fluid.

 

Таблица 3. Результаты полученного материала

Table 3. Results of the received material

	Пациентка 1	Пациентка 2	Пациентка 3	Пациентка 4	Пациентка 5
GV	0	3	1	7	3
MI	2	3 (витрифицированы)	1	5	3
MII	1	8 (витрифицированы)	3 (витрифицированы)	10	8 (витрифицированы)
Эмбрионы	1 (витрифицирован)	0 (не оплодотворяли)	0 (не оплодотворяли)	3 (витрифицированы)	0 (не оплодотворяли)
Дегенерировали	1	3	1	3	1

 

Также следует отметить, что IVM проведено в различные дни менструального цикла. Существенных различий в количестве полученных КОК не наблюдалось. Это может говорить о том, что выполнение данной технологии возможно в любой день менструального цикла.

Последние исследования, проведенные в мире, показывают, что в среднем количество ооцитов, полученных из удаленной ткани яичника, составляет 14,7±2,2, а среднее количество созревших КОК после 24–48 ч культивирования – от 23 до 62% [15, 16]. В нашем исследовании из ткани яичника, полученного в ходе овариэктомии у пациентки 5, извлечено 19 незрелых КОК. Через 48 ч культивирования в среде VM – 8 ооцитов на стадии MII, 3 ооцита – на стадии MI, 3 ооцита – на стадии GV. Процесс получения фолликулярной жидкости с незрелыми КОК представлен на рис. 3. Криоконсервированы 11 (57,9% от всех полученных КОК) ооцитов на стадии MI и MII, что сопоставимо с данными литературы.

 

Рис. 3. Пункция фолликулов из удаленной ткани яичника.

Fig. 3. Puncture of follicles from the removed ovarian tissue.

 

По итогу всего получено 46 незрелых КОК. Через 28 ч после культивирования ооцитов в среде IVM получено 30 (46%) ооцитов на стадии MII, 14 (22%) ооцитов на стадии MI и 12 (18%) ооцитов на стадии профазы I (GV). После дополнительного культивирования через 24 ч еще 1 ооцит достиг стадии MII. Наглядное распределение всех полученных ооцитов представлено на рис. 4.

 

Рис. 4. Общее количество полученных ооцитов на разных стадиях развития.

Fig. 4. The total number of oocytes obtained at different stages of development.

 

В целом, по данным мировой литературы, среднее количество ооцитов, полученных после IVM без стимуляции яичников, у онкологических больных колеблется от 5 до 17, а скорость созревания колеблется от 50 до 61,2% [14]. В нашем исследовании 21 ооцит достиг зрелости, что составляет 45,6%. Ооциты могут быть криоконсервированы либо на стадии GV, либо на стадии зрелого MII. В настоящее время в основном существуют данные о качестве ооцитов на стадии GV, полученных в результате овариальной стимуляции. Однако, по данным ряда авторов, эти качества отличаются у GV-ооцитов, полученных в результате IVM. Результаты показывают, что частота созревания ооцитов на стадии GV выше, если IVM выполняется до витрификации [17].

Заключение

IVM является перспективным методом, который дает возможность сохранения генетического материала пациенток с онкологическими заболеваниями в короткие сроки, не откладывая начало лечения гонадотоксичной терапией, позволяя в дальнейшем осуществить им свою репродуктивную функцию. Для получения удовлетворительного результата необходим достаточный овариальный резерв, так как имеется зависимость между уровнем АМГ, КАФ и получаемыми КОК. Также следует отметить, что фаза менструального цикла не имеет значения для проведения данной методики, так как количество полученных ооцитов в различные дни сопоставимо.

IVM может быть предложена пациенткам с РМЖ с высокой экспрессией ER, которым противопоказана гормональная стимуляция как альтернативный метод сохранения фертильности. Также возможно получение ооцитов из удаленной ткани IVM ex vivo, что является перспективным для пациенток с образованиями яичников. Эффективность данной процедуры сравнима с экстракорпоральным оплодотворением с овариальной стимуляцией, что подтверждается данными нашего наблюдения, а также мировой литературы.

С учетом малого количества исследований и отсутствия надежных протоколов использования IVM необходимы дополнительные исследования в данной области.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Информированное согласие на публикацию. Пациент подписал форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patient for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом (выписка из протокола локального этического комитета ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» №213). Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской конвенции.

Ethics approval. The study was approved by the local ethics committee (extract from the protocol of the Local Ethics Committee of the Pirogov Russian National Research Medical University №213). The approval and procedure for the protocol were obtained in accordance with the principles of the Helsinki Convention.

About the authors

Irina A. Lapina

Pirogov Russian National Research Medical University

Author for correspondence.
Email: doclapina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2875-6307

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Yulia E. Dobrokhotova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: pr.dobrohotova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7830-2290

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Moscow

Iurii A. Sorokin

Clinical and Diagnostic Center “Medsi” on Solyanka

Email: sorokin_y@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9305-323X

Head of the Clinical and Diagnostic Center

Russian Federation, Moscow

Anastasia A. Malakhova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: anastasimed@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2140-8000

Graduate Student

Russian Federation, Moscow

Tatiana G. Chirvon

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: tkoltinova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8302-7510

Graduate Student

Russian Federation, Moscow

Vladislav V. Taranov

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: vlastaranov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2338-2884

Graduate Student

Russian Federation, Moscow

Natalya Iu. Germanovich

Vishnevsky National Medical Research Center for Surgery

Email: anastasimed@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7857-275X

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Eugenia V. Kovalskaya

Clinical and Diagnostic Center “Medsi” on Solyanka

Email: anastasimed@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5754-1711

Leading embryologist

Russian Federation, Moscow

Olesya V. Kaikova

Clinical Hospital №2 “Medsi”

Email: anastasimed@yandex.ru

Department Head

Russian Federation, Moscow

Valeriia M. Gomzikova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: gomzval1402@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6297-8811

Resident

Russian Federation, Moscow

Maria A. Tverdikova

Clinical and Diagnostic Center “Medsi” on Solyanka

Email: vlastaranov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0462-2838

gynecologist, Clinical and Diagnostic Center

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files