Antitumor immune cycle proteins and HPV status in patients with HSIL and cervical cancer

Full Text

Рак шейки матки (РШМ) является частой злокачественной опухолью среди женщин во всем мире [1]. В России в 2021 г. грубый показатель заболеваемости составил 19,5 на 100 тыс. женского населения [2]. РШМ представляет собой стадийный процесс, развивающийся путем малигнизации интраэпителиальных поражений высокой степени (HSIL). Одним из главных триггеров, потенцирующих развитие как HSIL, так и РШМ, является вирус папилломы человека (ВПЧ) канцерогенного риска, детектируемый в 70–100% случаев [3].

После революционного открытия Джеймсом Аллисоном и Тасуку Хондзе успешного использования иммунотерапии в онкологии появляется все больше публикаций, касающихся изучения противоопухолевого иммунного цикла (ПИЦ) и возможностей использования этих данных в клинической практике [4–6].

ПИЦ происходит в иммунологическом синапсе – месте контакта опухолевой клетки, клеток иммунной системы и клеток опухолевого микроокружения. Последовательность взаимодействий между указанными клетками и представляет собой ПИЦ. Этапы ПИЦ: высвобождение антигенов опухолевыми клетками, антиген-презентация, дифференцировка Т-лимфоцитов, миграция Т-лимфоцитов к опухолевой клетке, инфильтрация опухоли, распознавание и уничтожение опухолевых клеток [5].

В последнее время в литературе появляются данные об изучении роли ВПЧ в регуляции ПИЦ как механизма формирования резистентности опухоли к противоопухолевому иммунному ответу, прогрессированию злокачественного процесса. Однако при РШМ имеющиеся сведения ограничиваются изучением лишь отдельных белков ПИЦ и не касаются исследования уровня экспрессии ПИЦ в зависимости от ВПЧ-инфицирования [7].

Цель исследования – изучить уровень белков ПИЦ (sCD25, 4-1BB, B7.2, TGF-b1, CTLA-4, PD-L1, PD-1, Tim-3, LAG-3, Galectin-9, sCD27, PD-L2) у больных с HSIL и РШМ в зависимости от особенностей ВПЧ-статуса.

Материалы и методы

В проспективное исследование включены пациентки с морфологически подтвержденными диагнозами HSIL (n=53, средний возраст – 32,2±5,6 года) и РШМ I–III стадий (n=101, средний возраст – 38,2±9,0 года), проходившими обследование и лечение на базе ГУЗ «Забайкальский краевой онкологический диспансер».

Критерии включения в исследование: морфологически подтвержденный диагноз HSIL или РШМ, выполненная процедура полного клинического обследования согласно действующим профильным клиническим рекомендациям [8, 9], репродуктивный возраст, подписанное согласие пациентки (форма утверждена локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ЧГМА), отсутствие воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы.

Контрольную группу составили женщины-добровольцы без наличия патологии шейки матки, что подтверждено цитологическим исследованием по Папаниколау (n=30, средний возраст – 40,0±3,2 года). Исследуемые группы сопоставимы по сопутствующей патологии.

Материал для исследования – цервикальный эпителий, методика забора которого соответствовала рутинной практике забора цитологического материала посредством цитощетки (сervex-brush) с зоны трансформации.

Методом проточной цитометрии CytoFLEX LX (Beckman Coulter, США) с использованием панели HU Immune Checkpoint Panel 1- S/P (10-plex) w/FP (Канада) изучали следующие белки ПИЦ: sCD25, 4-1BB, B7.2, TGF-b1, CTLA-4, PD-L1, PD-1, Tim-3, LAG-3, Galectin-9, sCD27, PD-L2.

ВПЧ-статус определяли путем тестирования с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (амплификатор детектирующий «ДТпрайм», Россия) отделяемого цервикального канала для выявления качественного и количественного определения ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59).

Вирусная нагрузка (ВН) градировалась: низкая клинически малозначимая – ВН<3 lg копий/10⁵ клеток; умеренная клинически значимая ВН 3–5 lg копий/10⁵ клеток; высокая – ВН≥5 lg копий/10⁵ клеток.

При проведении статистического анализа авторы руководствовались едиными требованиями для рукописей, подаваемых в биомедицинские журналы, и рекомендациями «Статистический анализ и методы в публикуемой литературе» (SAMPL) [10].

Статистическая обработка осуществлялась с применением пакета программ IBM SPSS Statistics Version 5.0 (International Business Machines Corporation, license No. Z125-3301-14, США) методами непараметрической статистики с расчетом критерия Краскела–Уоллиса с определением критерия значимости p. Подгрупповой анализ проводился путем попарного сравнения исследуемых показателей с применением U-критерия Манна–Уитни. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

ВПЧ выявлен у 80,2% у больных с HSIL и у 80% пациенток с РШМ. Преобладающим генотипом в обеих клинических группах стал серотип ВПЧ 16. Статистически значимых различий по частоте встречаемости отдельных генотипов ВПЧ среди исследуемых групп не выявлено.

В группе HSIL наиболее часто встречалась микстВПЧ- инфекция: 57,8% против 47,3% при РШМ (χ²=8,11; p=0,017).

У больных РШМ ВН оказалась выше в 1,5 раза (χ²=139,7; p<0,001) и составила 5,97 [5, 0; 6, 0] lg копий/105 клеток.

Отличия по содержанию белков ПИЦ в зависимости от ВПЧ статуса выявлены только у больных РШМ. Повышение локальных величин 4-1ВВ, PD-1, PD-L2 на 89,8% (p=0,037), 83,4% (p=0,031), в 2,4 раза (p=0,001) соответственно выявлено у больных РШМ с ВПЧ+ статусом (табл. 1).

 

Таблица 1. Локальный уровень белков ПИЦ у больных с HSIL и РШМ в зависимости от ВПЧ-статуса (Ме [25; 75-й перцентили]), пг/мл

Table 1. The local level of the anti-tumor immune cycle (AIC) proteins in patients with high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) and cervical cancer (CC) depending on human papillomavirus (HPV) status (Me [25; 75th percentile]), pg/mL

Группа	HSIL		РШМ		Статистическая значимость
Показатель, пг/мл	ВПЧ- (n=11)	ВПЧ+ (n=42)	ВПЧ- (n=19)	ВПЧ+ (n=74)
4-1BB	25,8 [17, 2; 34, 7]	18,2 [51, 5; 97, 7]	24,6 [18, 5; 30, 8]	46,7 [40, 2; 53, 2]	U1=208,5 p1=0,017 U2=512,5 p2=0,037
PD-1	93,3 [65, 4; 121, 2]	33,6 [55, 0; 100, 0]	36,7 [24, 2; 49, 3]	67,3 [58, 4; 76, 1]	U1=321,5 p1=0,725 U2=504,0 p2=0,031
PD-L2	33,5 [28, 9; 52, 2]	65,4 [48, 6; 82, 1]	16,9 [15, 4; 21, 4]	40,3 [34, 5; 46, 1]	U1=313,0 p1=0,613 U2=369,0 p2=0,001
Примечание. Здесь и в табл. 2: указаны только статистически значимые величины; индекс 1 для U и p – значения для HSIL; индекс 2 для U и p – значения для РШМ.

 

У больных РШМ с микст-ВПЧ-инфекцией выявлено снижение локальной величины sCD27 на 55,6% (p=0,019); табл. 2.

 

Таблица 2. Локальный уровень белков ПИЦ у больных с HSIL и РШМ в зависимости от варианта ВПЧ-инфекции (Ме [25; 75-й перцентили]), пг/мл

Table 2. The local level of AIC proteins in patients with HSIL and CC depending on HPV infection type (Me [25; 75th percentile]), pg/mL

Группа	HSIL		РШМ		Статистическая значимость
Показатель, пг/мл	моноВПЧ (n=20)	микстВПЧ (n=22)	моноВПЧ (n=78)	микстВПЧ (n=35)
sCD27	27,4 [24, 0; 30, 8]	21,3 [17, 9; 21, 9]	38,3 [34, 2; 42, 4]	17,0 [14, 6; 19, 5]	U1=60,0 p1=0,257 U2=98,5 p2=0,019

 

Статистически значимых различий по уровням белков ПИЦ в зависимости от величины ВН ВПЧ у больных с HSIL и у пациенток с РШМ не выявлено.

Обсуждение

Нарушение регуляции ПИЦ является одной из причин опухолевой прогрессии [4–6]. Низкая иммуногенность опухоли, нарушение презентации антигена, нарушение межклеточного взаимодействия путем экспрессии ингибиторов ПИЦ, блокирование хемотаксиса лимфоцитов, атипичный метаболизм опухолевых и иммунных клеток являются только частью примеров механизмов блокирования ПИЦ, что потенцирует опухолевый рост [5].

Имеются сведения о том, что при HSIL и РШМ ВПЧ канцерогенного риска могут оказывать влияние на течение ПИЦ. В частности, в ВПЧ-позитивных образцах тканей РШМ уровень экспрессии ингибиторов ПИЦ – PD-L1 и PD-1 – положительно коррелирует с высоким уровнем белка P16INK4a, низким содержанием провоспалительных цитокинов [7].

В настоящем исследовании мы впервые изучили локальный уровень комплекса белков ПИЦ в зависимости от ВПЧ-статуса у больных с HSIL и РШМ.

Полученные данные указывают на увеличение уровня экспрессии ингибиторов ПИЦ: PD-1, PD-L2 у больных РШМ с ВПЧ-инфекцией, sCD27 у больных РШМ с моноВПЧ-инфекцией.

Взаимосвязи между величиной ВН ВПЧ и показателями локальных уровней белков ПИЦ у больных с HSIL и РШМ не выявлено. Прогностическое и диагностическое значение ВН ВПЧ в настоящее время окончательно не определено и активно обсуждается исследователями. Ряд авторов указывают на необходимость определения не количественной ВН, а степени интеграции ВПЧ [11].

Заключение

Таким образом, актуальной задачей современности являются дальнейшие исследования по изучению влияния ВПЧ-инфекции на механизмы регуляции ПИЦ с целью улучшения понимания механизмов развития РШМ и совершенствования методов лечения, главным образом для больных генерализованным и рецидивирующим РШМ.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Информированное согласие на публикацию. Пациенты подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ЧГМА (протокол №2 заседания от 26 сентября 2017 г.). Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской конвенции.

Ethics approval. The study was approved by the local ethics committee of Chita State Medical Academy (Minutes №2 of the meeting dated September 26, 2017). The approval and procedure for the protocol were obtained in accordance with the principles of the Helsinki Convention.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-6143.2018.7 (соглашение №075-02-2018-547).

Funding source. The study was supported by a grant from the President of the Russian Federation for government support of young Russian scientists MK-6143.2018.7 (agreement №075-02-2018-547).

About the authors

Elena V. Kayukova

Chita State Medical Academy

Author for correspondence.
Email: elena_pochta22@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4682-1811

Cand. Sci. (Med.), Chita State Medical Academy

Russian Federation, Chita

Tatiana E. Belokrinitskaya

Chita State Medical Academy

Email: tanbell24@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5447-4223

D. Sci. (Med.), Prof., Chita State Medical Academy

Russian Federation, Chita

Svetlana V. Romanyuk

Chita State Medical Academy

Email: romanyuks2013@mail.ru

Cand. Sci. (Med.), Chita State Medical Academy

Russian Federation, Chita

References

Supplementary files