Rol' nesluchaynoy inaktivatsii Kh-khromosomy v formirovanii prezhdevremennoy nedostatochnosti funktsii yaichnikov

Full Text

Преждевременная яичниковая недостаточность (ПНЯ) описывается как "многофакторный синдром", в развитии которого могут принимать участие генетические, иммунные, инфекционные, ятрогенные, психогенные и другие факторы [1]. Данная патология проявляется вторичной аменореей, низким уровнем эстрогенов, бесплодием на фоне повышенного уровня гонадотропинов (ФСГ, ЛГ). В структуре первичной аменореи ПНЯ составляет 10-28% [2]. У женщин с вторичной аменореей ПНЯ встречается с частотой 4-18% [3]. Согласно точке зрения большинства исследователей, ПНЯ формируется в результате делеций как в коротком, так и в длинном плечах Х-хромосомы (Xq) или наличия моногенных заболеваний. Делеции длинного плеча Хq представлены множеством вариантов. Область Xq13 является наиболее важным районом для поддержания функционирования яичников. Возможно, в этом участке находится центр инактивации Хq, что подтверждается клинической картиной, характерной для гипергонадотропного гипогонадизма. Наиболее протяженные делеции захватывают область Xq13 и ассоциированы с первичной аменореей, отсутствием молочных желез и полным истощением яичников [4-8]. Для Xq не найдено каких-либо определенных точек разрыва, хотя в свете современных молекулярно-генетических открытий терминальные делеции можно расположить по значимости их влияния на функционирование яичников в таком порядке: Xq13-21, Xq22-25 и Xq26-28. В 1995 г. Ogata и Matsuo выявили сильную корреляционную зависимость между функционированием яичников и представленной выше последовательностью делеций в длинном плече Хq [8]. Инактивация Хq (ИХХ) характерна для млекопитающих и заключается в том, что одна из двух родительских Хq (отцовская или материнская) случайным образом инактивируется для обеспечения одинакового количества функционирующих X-сцепленных генов у представителей обоих полов [9]. Однако в ряде случаев имеет место избирательная ИХХ одного из родителей. Существуют данные о том, что неслучайная ИХХ встречается в норме в экстраэмбриональных тканях [10], а также при некоторых патологических состояниях: у мозаиков 45Х/46ХХ [11], у женщин со структурными аберрациями Хq [12], у бессимптомных носителей синдрома Ретта (Х-сцепленное доминантное заболевание) [13] и при поликистозе и преждевременном истощении яичников [9, 14]. В целом частота неслучайной ИХХ в популяциях оценивается в 1,5-3,5% (Gale и соавт. 1997; Plenge и соавт. 1997; Lanasa и соавт. 1999) [15]. Выявление неслучайной ИХХ осуществляется с помощью методов, основанных на определении дифференциального метилирования активной и неактивной Хq. Непосредственно анализируются полиморфизмы Х-сцепленных генов - полиморфизм сайта узнавания рестриктазы BstXl в первом интроне гена фосфоглицерокиназы [10] или полиморфизм CAG-повтора в первом экзоне гена андрогенового рецептора (AR) [10, 16]. В том числе можно использовать метилчувствительную или метилспецифическую ПЦР с целью определения неслучайной инактивации Хq у пациентов с ПНЯ. Материалы и методы Обследованы 72 женщины с ПНЯ. Средний возраст пациенток составил 33,4±0,8 года, средняя продолжительность заболевания - 6,3±0,7 года, средний уровень ФСГ - 106,4±4,8 МЕ/л, ЛГ - 90,5±5,6 МЕ/л, Е2 - 76,7±9,7 МЕ/л, ТТГ - 2,7±0,38 мМЕ/л, ингибин В - 10,6±1,16 пг/л при двух определениях. У этих пациенток самостоятельная менструация отсутствовала 6 мес и более. Исследование проводили у женщин Европейской части России. Больным осуществляли полное клиническое обследование, включающее семейный анамнез, данные о менархе и регулярности предшествующих менструаций, акушерский анамнез. Всем обследованным проводили гинекологический осмотр, ультразвуковое исследование органов малого таза, определение уровней гормонов (ФСГ, ЛГ, ТТГ, Е2, ингибин В) и кариологическое исследование. Цитогенетический анализ Хромосомные препараты готовили из культуры лимфоцитов периферической крови. Подсчитывали под микроскопом не менее 25 метафазных пластинок. Детальный анализ хромосом проводили на микрофотографиях с составлением кардиограммы. Дифференцированное окрашивание хромосом (G-метод) проводили по методу Seabright с предобработкой трипсином. Выделение ДНК и определение неслучайной инактивации Xq Геномную ДНК выделяли по модифицированному методу фенол-хлороформной экстракции [17]. Затем геномную ДНК обрабатывали рестриктазой Hhal, которая только в том случае гидролизует цепи ДНК, если цитозин CpG-динуклеотида в ее сайтах узнавания не метилирован. Состав реакционной смеси: геномная ДНК - 1-2 мкг, буфер SEBufferY(lOx) ("СибЭнзим", Новосибирск) - 2 мкл, рестриктаза Hhal ("СибЭнзим", Новосибирск) - 10 ед., деионизированная вода - до 20 мкл. Реакционную смесь инкубировали при температуре 65°С в течение суток. Далее проводили ПЦР по описанному выше протоколу, как матрицу использовали 2 мкл смеси продуктов рестрикции. Длину CAG-повтора в гене AR определяли с помощью количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (КФ-ПЦР). Последовательности праймеров и условия амплификации описаны ранее [18]. Аналогом праймера CAGF2-HEX являлся праймер CAGF2-FAM (конъюгированный на 5-м конце с флуоресцентным красителем FAM). Фрагментный анализ осуществляли разделением ПЦР-продуктов на генетическом анализаторе ABI3100 согласно протоколам ABI Prism 3100 Genetic Analyzer Kits "Applied Biosystems". Идентификацию аллелей проводили с помощью программного обеспечения GeneMapper v. 3.5 "Applied Biosystems". Во всех информативных случаях определялась ИХХ. Считалось, что ИХХ имеет место при выполнении двух условий: отношение площади большего пика к сумме площадей двух пиков превышает 70% и при амплификации с рестриктов и нативной геномной ДНК это отношение отличается более чем на 3% [9, 14]. Кроме того, исследование проводилось в пороговых уровнях 80 и 90%. Таблица 1. Цитогенетический анализ Кариотип Больные с ПНЯ 46,ХХ 69 (95,8%) 46,XX/45,X/47,XXX 2 (2,8%) 46,Х 1 (1,4%) Таблица 2. Частота неслучайной ИХХ Пороговый уровень Частота неслучайной ИХХбольные с ПНЯ ³90 3,3% (2/60) ³80 11,7% (7/60) ³70 25% (15/60) Результаты При изучении семейного анамнеза у 19 (26,4%) матерей наших пациенток отмечено несвоевременное выключение функции яичников: у 8 (11,1%) матерей преждевременная недостаточность яичников (до 40 лет), а у 11 (15,3%) - ранняя менопауза (до 45 лет). У матерей 8 (11,1%) пациенток были выявлены в анамнезе различные нарушения менструального ритма. Изучение преморбидного фона показало, что 45 (62,5%) больных имели высокий инфекционный индекс. Регулярные менструации установились с менархе у 60 (83,3%) женщин, средний возраст менархе составляет 13,2±1,4 года, олигоменорея отмечена у 12 (16,7%) больных. У 25 (34,7%) из 72 пациенток с ПНЯ в анамнезе были роды. У 19 (26,4%) пациенток - 1, у 6 (8,3%) - 2 родов. У 23 (31,9%) пациенток этой группы были аборты, у 4 (5,6%) - самопроизвольные выкидыши. В группе нерожавших пациенток аборты были только у 6 (8,3%) женщин. Таким образом, до начала заболевания фертильность была сохранена у 31 (43%) женщин с ПНЯ, т.е. практически у каждой 2-й пациентки. При клиническом обследовании 71 пациентки с ПНЯ выявлено: средний рост составил 161,5±3,8 см, средняя масса тела - 57,9±1,4 кг, индекс массы тела (ИМТ) - 24,7±3,6 кг/см2. Отмечено, что все женщины были правильного телосложения, с нормальным женским фенотипом, сохраненным интеллектом и у них отсутствовали какие-либо аномалии развития. Всем обследованным женщинам с ПНЯ было произведено исследование кариотипа. Среди 72 обследованных нами женщин аберрации Хq обнаружены у 3 (4,2%), из них 2 (2,8%) характеризовались низким уровнем мозаицизма и у 1 (1,4%) женщины - кариотип 45,Х. Данная пациентка фенотипически отличалась от описанных ранее больных низким ростом (150 см), диспластичными чертами - наличием деформированных ушных раковин, высоким арковидным небом, аномальным расположением зубов, короткой толстой шеей, низким ростом волос на затылке, широко расставленными сосками, наличием митрально-аортального порока сердца и аномальным развитием почек. Из 69 пациенток с нормальным кариотипом только 60 (87%) были гетерозиготы (информативны) по полиморфизму CAG-повтора гена андрогенного рецептора. Доля гомозигот по анализируемому локусу составила 9 (13%) женщин. Таким образом, количество информативных образцов ДНК составило 60 (87%). Для оценки неслучайной ИХХ мы использовали три пороговых уровня, классифицируемых, как ³70, ³80, ³90%. Среди этих 60 женщин гетерозигот у 25% (15/60) была выявлена неслучайная инактивация Хq ³70%, у 11,7% (7/60)³80%, у 3,3% (2/60) ³90%. Результаты цитогенетического анализа представлены в табл. 1, а частота неслучайной ИХХ - в табл. 2. Обсуждение В этом исследовании мы попытались разобраться, действительно ли неслучайная ИХХ имеет отношение к формированию ПНЯ. В задачу работы также входило изучение численных аномалий Хq у больных с ПНЯ. При исследовании кариотипа мы выявили 1 пациентку с наличием аномального клона 45,Х в кариотипе и 2 пациенток с низким уровнем мозаицизма по половым хромосомам 45,Х/46,ХХ (см. табл. 1). Подобные результаты описаны в литературе [19-21]. Подтверждением полученных нами данных являются ранее проведенные клинические наблюдения, согласно которым от 3 до 5% женщин с мозаичным 46,ХХ/45,Х кариотипом самостоятельно менструируют и в ряде случаев у них наступают самостоятельные беременности [22, 23]. Magee и соавт. описали пациентку с 45,Х-кариотипом, у которой было семь самостоятельно наступивших беременностей, однако скорее всего автор обследовал пациентку, имевшую ярко выраженный тканевый мозаицизм 46,ХХ/45,Х с преобладанием первого в яичниках, а второго в лимфоцитах периферической крови. Следует подчеркнуть, что у человеческого эмбриона 45,Х подобно всем млекопитающим с моносомией первично присутствуют герменогенные клетки, сохранение которых возможно в единичных экземплярах и является ключом к разгадке механизма фертильности при синдроме Тернера [24]. В ранее описанном случае больная с кариотипом 45,Х регулярно менструировала до 38 лет, однако подобно больным с дисгенезией гонад (синдром Тернера) она страдала митрально-аортальным пороком сердца и врожденной аномалией почек. Также обращало на себя внимание наличие у нее диспластичных черт, характерные для синдрома Тернера. Powell и соавт. высказали гипотезу о том, что ПНЯ может быть результатом нарушений в работе ограниченного числа генов, задействованных в развитии яичников [25, 26]. Широкий спектр аномалий Хq может вызвать патологию мейоза и в результате приводить к частичной гибели половых клеток [27]. Поэтому истощение запаса ооцитов у женщин может быть непосредственно связано с неспособностью обеспечить функционирование яичников в течение репродуктивного возраста. Однако мозаицизм 45,Х/46,ХХ в незначительном количестве клеток часто встречается в норме и увеличивается с возрастом [28-32]. Следовательно, наличие мозаицизма 45,Х/46,ХХ в незначительном проценте может и не является предрасполагающим фактором к ПНЯ. Установлено, что около 5% из 2000 генов, локализованных на Хq, избегают инактивации [33]. Гены кандидаты, участвующие в поддержании функции яичников, вероятно, находятся в этих эухроматиновых районах, однако до настоящего времени не проведены исследования, однозначно подтверждающие эту гипотезу. Исключив женщин с аберрациями Хq, мы определили Х-инактивационный статус. Для оценки неслучайной ИХХ мы использовали пороговый уровень ³70%, ³80%, ³90%. Частота случаев инактивации Хq у обследованных нами женщин с ПНЯ составил ³70-25%, ³80 - 11,7%, ³90 - 3,3%, в то время как в популяции, по данным Gale, Plenge, Lanasa, показатель ИХХ в пороговом уровне 70 и более составляет от 1,5-3,5%, что в 7,5 раз ниже полученных нами данных. При анализе результатов целесообразно отметить, что различные авторы предлагают отличающиеся друг от друга методы определения неслучайной инактивации Xq-хромосомы по CAG-повтору гена AR с детекцией меченых ПЦР-продуктов на генетических анализаторах. Например, в работе Sato и соавт. использовалась метилспецифическая ПЦР, а расчеты произведены для трех пороговых уровней: 70, 80 и 90% [9]; в работе Dijk и соавт. использовалась метилчувствительная ПЦР, рестриктаза Hpall, а пороговый уровень рассчитывался как изменение показателя ИХХ более чем на 30% при амплификации ДНК, обработанной Hpall, относительно нативной геномной ДНК [34]. В настоящей работе условия определения неслучайной инактивации по CAG-повтору AR также имели оригинальные модификации. Указанные различия в методах могут существенно влиять на частоту выявления неслучайной инактивации Хq. Это указывает на необходимость создания общепринятого протокола определения дифференциального метилирования Xq. Основываясь на данных об увеличении частоты неслучайной ИХХ с возрастом, мы проанализировали возраст 15 пациенток с ИХХ, который варьировал от 21 года до 43 лет. Таким образом, средний возраст пациенток составил 35,1±1,9 года, в связи с чем мы предположили, что как минимум один компонент неслучайной ИХХ не ассоциирован с возрастом, а связан с формированием ПНЯ. Как уже было сказано по поводу синдрома Тернера, некоторые гены, необходимые для функционирования яичников, могут быть необходимыми в 2 активных копиях и поэтому избегают ИХХ [35]. Предполагается, что незначительные структурные аберрации Хq могут приводить к ее неравновесной инактивации и далее к ПНЯ вследствие недостаточного функционирования генов, необходимые для развития яичников. Таким образом, одно из возможных объяснений состоит в том, что неслучайная ИХХ и связанные с ней ПНЯ являются результатом генетических нарушений, которые избирательно инактивируют и приводят к недостаточному функционированию генов, задействованных в формировании и развитии достаточного фолликулярного пула яичников. Поскольку случаи ярко выраженной неслучайной ИХХ были отмечены у женщин с ПНЯ, то мы предположили скрытые аномалии или мутации, которые не были идентифицированы при стандартном применении G-окраски, но эти нарушения могли привести к неслучайной ИХХ, клеточной селекции и затем к ПНЯ. Гены, вовлеченные в поддержание функционирования яичников, могут быть непосредственно повреждены при структурных аномалиях Хq и вызвать дисфункцию яичников. Генетические нарушения могут приводить к потере герменогенных клеток или снижению их количества относительно других клеточных субпопуляций, сопровождающихся неравновесной ИХХ и ПНЯ. Таким образом, генетические факторы могут играть важную роль в развитии ПНЯ. Для установления природы этих факторов необходимы дальнейшие исследования групп сцепления в семьях, что подтверждается особенностями семейного анамнеза у наших пациенток.

About the authors

L A Marchenko

D V Zaletaev

Z G Gabibullaeva

D S Mikhaylenko

References

Supplementary files