Molekulyarnye mekhanizmy didrogesterona (Dyufaston®). Polnogenomnoe issledovanie transkriptsionnykh effektov retseptorov progesterona, androgenov i estrogenov

Full Text

Резюме Дидрогестерон – высокоселективный прогестаген, использующийся при широком спектре гинекологических заболеваний. Из всех стероидных рецепторов дидрогестерон значительно взаимодействует только с прогестерон-рецепторами. Результаты проведенного нами ранее исследования моделей структур комплекса прогестин–рецептор позволяют предположить, что ключевым моментом высокой селективности и специфичности дидрогестерона является уникальное для этой молекулы позиционирование метильной группы С19. Некоторые другие препараты прогестинов взаимодействуют и с другими типами рецепторов и как следствие приводят к нежелательным побочным эффектам. Побочными эффектами применения некоторых прогестинов являются вирилизация, являющаяся результатом активации андрогенных рецепторов, а также нежелательная активация эстрогеновых рецепторов. В настоящей работе мы приводим результаты полногеномного исследования транскрипционных эффектов активации прогестероновых, андрогенных и эстрогеновых рецепторов. Результаты показывают, что эти три типа рецепторов активируют существенно разные группы генов. Путем анализа функционального связывания установлены гены, предположительно влияющие на вирилизацию или феминизацию плода. Результаты исследования подчеркивают, что использование разновидностей прогестинов, побочно активирующих эстрогеновые или андрогеновые рецепторы, нежелательно при беременности и вмешивается в гормональные процессы развития плода. И, наоборот, применение во время беременности высокоселективных прогестинов (например, дидрогестерона) является безопасным для правильного развития плода как женского, так и мужского пола. Введение Прогестагены – стероидные гормоны, необходимые для поддержания беременности и других функций (например, поддержки менструального цикла). Идея использовать препараты прогестерона для лечении угрозы прерывания беременности относится к 1960-м годам [1]. Необходимость прогестерона в поддержании беременности показана в экспериментах, в которых индуцировалось прерывание беременности введением антител к прогестерону. Выкидыш предотвращался введением прогестерона. Однако длительное время применение прогестерона в виде инъекций масляного раствора не рекомендовалось в связи с тем, что, как полагали, он обладает слабым вирилизирующим действием на плод женского пола. Дискуссия о том, оказывают ли гестагены, применяемые во время беременности, какое-либо влияние на плод, в том числе на его физическое и половое развитие, продолжается. Именно эти вопросы заставляют задуматься о том, какие именно эффекты реализуются посредством воздействия лекарственного препарата (прогестагена) на разные типы стероидных рецепторов. Дидрогестерон (действующее начало препарата Дюфастон®) – высокоселективный прогестаген, не обладающий андрогенными или эстрогенными свойствами. Как показали результаты проведенного нами ранее исследования структурных и энергетических свойств моделей прогестин–рецептор [2], дидрогестерон характеризуется одной из самых высоких энергий связывания с прогестероновым рецептором и самыми низкими энергиями связывания с другими разновидностями стероидных рецепторов. Пертурбационный анализ структуры дидрогестерона показал, что наличие метильной группы С19 в a-положении является наиважнейшим фактором, определяющим высокую активность и специфичность дидрогестерона (рис. 1). Проведенное нами изучение моделей структур прогестин–рецептор указало, в частности, на необходимость проведения рентгеноструктурных исследований комплексов дидрогестерона и прогестерона с лигандосвязывающими доменами стероидных рецепторов и, что не менее важно, проведение сравнительных исследований связывания дидрогестерона и прогестерона с ферментами биосинтеза стероидов. Экспериментальное установление структур комплексов «лекарство–белок» – одна из основных характеристик любого препарата в современной молекулярной и клинической фармакологии, указывающая на фундаментальные особенности исследуемого препарата. Помимо экспериментальных исследований структур комплексов «прогестин–белок», не менее важным является сравнительное изучение транскрипционной активности различных прогестинов. Хорошо известно, что основным клеточным механизмом биологического воздействия прогестерона и других стероидов является активация специальной разновидности рецептора, который затем перемещается в ядро клетки и активирует/модулирует транскрипцию многих сотен генов [3]. Обычно подобного рода исследования проводятся с использованием методов функциональной геномики и транскриптомики. Изучение транскриптомики того или иного препарата должно быть тщательно спланировано, включать адекватный выбор типов клеток и режима стимуляции [4]. Прогестины связываются со стероидными рецепторами и активируют транскрипцию генов. Некоторые прогестины или их метаболиты активируют не только прогестероновые рецепторы, но и другие типы стероидных рецепторов, что и приводит к побочным эффектам. В настоящей работе предпринята попытка смоделировать возможные различия в экспрессии генов, активируемых разными типами стероидных рецепторов. Принимая во внимание разную аффинность прогестинов к разным типам стероидных рецепторов [2], эти модельные данные по экспрессии генов будут отражать биологический эффект того или иного прогестина. Моделирование проводилось посредством полногеномного анализа сайтов связывания стероидных рецепторов. Для анализа использовался разработанный авторами интегральный метод аннотации генов и нуклеотидных полиморфизмов [4, 5]. Вирилизация (от лат. virilis – мужской), протекающая вследствие активации андрогенных рецепторов, – наиболее серьезный побочный эффект некоторых прогестинов или их производных. Излишняя активация эстрогеновых рецепторов также нарушает гормональный баланс и беременной, и плода. Более того, избыточная активация эстрогеновых рецепторов приводит к гиперпролиферации клеток и увеличивает риск канцерогенеза. Поэтому в данной работе изучалась сравнительная транскриптомика именно прогестеронового, андрогенного и эстрогенового рецепторов. Это исследование позволило получить детальную характеристику различий молекулярно-биологических механизмов действия дидрогестерона, прогестерона и других прогестинов. Методы исследования Анализ транскрипции определенными факторами транскрипции – составная часть интегрального метода аннотации генов и нуклеотидных полиморфизмов. Этот метод анализирует возможное функциональное значение каждого участка гена и находящихся в нем полиморфизмов[5] через систематический перебор фундаментальных молекулярно-биологических механизмов (транскрипция, трансляция, стабильность ДНК, функции белков и т.д.). Для предсказания возможных сайтов связывания стероидных рецепторов использовались статистические модели распознавания стероид-активных участков ДНК (steroid-responsive element – SRE). Известно, что консенсусная последовательность ДНК, соответствующая, например, эстроген-активному элементу (estrogen-responsive element – ERE), обычно цитируемая как GGTC-Annn-TGACC, варьирует в разных генах и может принимать такие формы, как GGGCA-nnn-TGACC, GGGCA-nnn-TGACT, GAGCA-nnn-TGCCC и т.д. [6, 7]. Для учета этих вариаций использовалась база данных более чем 600 экспериментально определенных последовательностей стероид-активных элементов ДНК [8]. Используя множественное выравнивание SRE, были рассчитаны матрицы позиционных весов. Элементы такой матрицы содержат информацию об идентичности соответствующих нуклеотидов ДНК и вычисляются по следующей формуле: где pi(x) – частота нуклеотида типа x в позиции i, i=1..L, где L – число нуклеотидов в интересующем нас SRE. В то время как именно мононуклеотидный вес позиций дает основной вклад, дополнение схемы распознавания парными и тройными сочетаниями («взаимодействиями») нуклеотидов значительно увеличивают аккуратность предсказания. Парные и тройные взаимодействия учитываются как произведение частот pi(x) индивидуальных нуклеотидов: Для распознавания, является ли последовательность S=s1, ..., sL длины L сайтом определенного типа SRE (т.е. прогестеронсвязывающим, андрогенсвязывающим и.т.д.), использовали матричные рейтинги сходства (отражающие, до некоторой степени, энергии связывания [9]), которые рассчитывали по следующей формуле: Для предсказания сайтов SRE использовался эмпирический критерий М>0.8. Потенциальные сайты связывания исследованных стероидных рецепторов (прогестеронового, андрогенового и эстрогенового) изучали в диапазоне – 4000..0 нуклеотидов от сайта начала транскрипции (ATG...). Списки генов, полученные в результате полногеномного предсказания сайтов транскрипции, анализировали посредством функционального связывания [5] с использованием функциональных категорий стандартной аннотации генома человека. Результаты исследования По результатам полногеномного анализа установлено, что активация прогестероновых рецепторов приведет к модулированию транскрипции по крайней мере около 1800 генов, активация эстрогеновых рецепторов – к модулированию экспрессии около 600 генов, а активация андрогенных рецепторов – к изменениям в транскрипции около 250 генов. Попарное сравнение этих трех списков генов показало значительные различия. Так, экспрессия только 59 генов может модулироваться как прогестероновыми, так и андрогенными рецепторами. Другими словами, прогестероновые рецепторы активируют около 1740 генов, которые не могут быть активированы андрогеновыми рецепторами. И, наоборот, андрогеновые рецепторы активируют около 200 генов, которые не активируются прогестероновыми рецепторами. Подобная ситуация наблюдается и по отношению к эстрогеновым рецепторам. Экспрессия 140 генов модулировалась и прогестероновыми, и эстрогеновыми рецепторами. Прогестероновые рецепторы активируют около 1660 генов, которые не могут быть активированы андрогеновыми рецепторами, а эстрогеновые рецепторы могут активировать около 460 генов, которые не активируются прогестероновыми рецепторами. Таким образом, активация андрогенового и эстрогенового рецепторов приводит к молекулярно-биологическим эффектам, существенно отличающимся от эффектов прогестерона. Очевидно, что сравнение функциональных особенностей столь больших массивов данных по экспрессии генов не может проводиться вручную и необходимо использовать какую-то форму компьютерной обработки данных. Для анализа функциональных сходств и различий использовали стандартные функциональные категории, которыми аннотирован геном человека (так называемые GO-категории, от англ. gene ontology). Более подробный анализ функциональных различий проводили посредством метода функционального связывания [5], позволяющего проверить отношение групп функциональных категорий к интересующему физиологическому процессу (например, вирилизации). Одним из показателей сходств и различий молекулярных эффектов генов является использование наиболее распространенных функциональных категорий («регуляция транскрипции», GO0006355; «внутриклеточная передача сигнала», GO0007165 и т.д.). Сравнение основных функциональных категорий 3 групп генов показало, что каждый из 3 рецепторов активирует гены, участвующие в фундаментальных клеточных процессах (рис. 2). В то же время процент этих генов достаточно невелик: например, гены, участвующие в процессах транскрипции, составляют менее 10% от всех активированных генов. Следует отметить, что списки генов, принадлежащие категориям «связывание цинка», «связывание ДНК», «фактор транскрипции», «регуляция транскрипции», совпадают не менее чем на 80%. Другими словами, белки, соответствующие этим генам, связывают цинк, ДНК и, являясь факторами транскрипции, регулируют этот фундаментальный клеточный процесс. ДНК-связывающие домены типа цинковый палец входят в состав по крайней мере 1/3 всех факторов транскрипции в геноме человека [10]. Например, все стероидные рецепторы содержат ДНК-связывающие домены типа цинковый палец. Последний факт имеет огромное значение для любой терапии стероидными препаратами. Цинк абсолютно необходим для активации ДНК-связывающих доменов рецепторов (рис. 3), и на фоне дефицита цинка активация транскрипции будет резко замедлена даже при связывании рецептором стероида-агониста, т.е., дефицит цинка имеет такой же функциональный эффект, как и дефицит стероидов. Поэтому эффективность терапии прогестинами может быть существенно снижена при дефиците цинка. Все рецепторы так или иначе стимулируют энергетический метаболизм (категория «митохондрии», GO0005739), но эти гены составляют менее 5% от всех генов, активированных тем или иным рецептором. Каждый из трех рассматриваемых типов стероидных рецепторов активирует гены, отвечающие за фундаментальные клеточные функции, приблизительно в одинаковой пропорции (см. рис. 2). Таким образом, принципиальные различия в транскрипционных эффектах, производимых исследуемыми стероидными рецепторами, следует искать в более специфических функциональных категориях генов, которые рассматриваются в последующих разделах. Прогестероновый рецептор Большинство эффектов прогестерона, включая влияние на овуляцию и имплантацию яйцеклетки в матку, опосредуется через рецепторы. В большинстве органов-мишеней экспрессия рецепторов прогестерона усиливается под влиянием эстрогена и ослабляется под влиянием самого прогестерона. Форма «В» рецептора приводит к пролиферации клеток, а форма «А» – препятствует пролиферации клеток, вызванной рецептором типа А и рецепторами эстрогенов. Обе формы имеют одинаковый стероидсвязывающий домен. Анализ комплексов прогестинов с этим доменом показал, что особенности структуры дидрогестерона приводят к специфической адаптации всей структуры стероидсвязывающего домена рецептора к молекуле дидрогестерона [2]. В настоящем исследовании найдено, что активация прогестероновых рецепторов приведет к модуляции траскрипции не менее 1800 генов. С помощью анализа функциональной связи найдено 60 специфических функциональных категорий, соответствующих уникальному влиянию активации именно прогестероновых рецепторов на транскрипцию. Данные по основным из этих категорий суммированы в табл. 1. Данные по функциональным категориям генов позволяют сделать несколько выводов о физиологических процессах, которые стимулируются прогестероном, но не андрогенами и не эстрогенами. Эти процессы относятся прежде всего к организму матери, хотя могут воздействовать и на развивающийся плод. Активация прогестероновых рецепторов приводит к экспрессии генов, связанных с ростом ткани. В частности, увеличиваются уровни агонистов/вспомогательных белков рецептора трансформирующего фактора роста (TGF-b) и рецептора фактора роста эпидермиса (EGF). Эти рецепторы через внутриклеточные сигнальные каскады типа MAPK (митогенактивируемые протеинкиназы) стимулируют прохождение клеточного цикла и деление клеток (переход G2/M при митозе клетки, репликация ДНК, ремонт ДНК, антиоксидантный ответ, стабилизация митотического веретена клатрином). Увеличивая экспрессию генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса, активированные прогестероновые рецепторы способствуют росту тканей и, в частности, эпидермиса. Имеются также неврологические (обонятельные рецепторы, серотониновые рецепторы, обучение и память) и соматические (терморегуляция, регуляция сердечных сокращений, артериального давления – АД) следствия активации прогестероновых рецепторов. Эти результаты важны как для понимания фундаментальных механизмов действия прогестинов, так и для осознанного применения различных прогестиновых препаратов в клинической практике. В табл. 2 проводится сравнение этих данных, полученных при проведении полногеномного анализа, с общеизвестными в акушерстве клиническими наблюдениями. Полногеномное сканирование позволило получить наиболее общий охват физиологических эффектов прогестерона. Каждый из нижеперечисленных выводов требует проведения отдельного систематического анализа с привлечением всех имеющихся биохимических, молекулярно-биологических и клинических данных. 1. Именно активация транскрипции серотониновых рецепторов, а не какие-либо воображаемые метаболиты прогестерона, приводит к формированию доминанты беременности. Более того, образование избыточных метаболитов при передозировках прогестероновых препаратов может активировать систему ГАМК и вызывать снижение внимания, когнитивных функций, а при более высоких дозировках – даже раздражение и агрессию. 2. Влияние активированных прогестероновых рецепторов на транскрипцию десятков генов обонятельных рецепторов – результат, который позволяет развить повышенную обонятельную чувствительность у беременных, определить пищевые предпочтения беременных и, вероятно, даже обосновать рекомендацию особых видов пищи в соответствии со специализацией установленных обонятельных рецепторов. 3. Усиление экспрессии рецептора фактора роста эпидермиса – EGF и генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса, указывает на стимулирование прогестероном развития эпидермиса. Это наиболее важно для организма будущей матери, так как обеспечивает увеличение площади кожи на животе и рост брюшинных складок для подготовки организма к родам. 4. Представляет особый интерес изучить более подробно регуляцию АД и токолитический эффект прогестинов в отношении миометрия. Известно, что дидрогестерон вызывает токолитический эффект, в том числе за счет снижения уровней простагландинов в эндометрии. В то же время дидрогестерон (Дюфастон®) в отличие от прогестерона не образует биологически активных производных, таких как, например, мифологические «b-метаболиты» и т.д. Следует отметить, что волюнтаристская и архаичная терминология типа «b-метаболит» практически неизвестна в современной научной литературе по биохимии и фармакологии (см., например, базу данных PubMed, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed). Поэтому токолитический эффект прогестинов можно отнести именно к активации прогестероновых рецепторов. Регуляция АД важна как фактор, предотвращающий появление и развитие гестозов. 5. Регуляция экспрессии интерлейкинов (ИЛ) и, возможно, других белков, вовлеченных в иммунный ответ, особенно интересна в связи с иммунотолерантностью во время беременности, благодаря которой возможны прогрессирование беременности и развитие плода. Исследования последних лет показали, что взаимодействие эндогенного прогестерона с собственными рецепторами приводит к стимуляции синтеза так называемого прогестерониндуцированного блокирующего фактора (PIBF), который запускает механизмы иммуносупрессии во время беременности: ингибирование цитотоксичности NK-клеток, изменение пути дифференциации Т-клеток в сторону Тh2, преобладание регуляторных противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10). Из всего ряда прогестагенных препаратов, применяемых во время беременности, доказанным воздействием на увеличение продукции PIBF обладает только дидрогестерон (Дюфастон®) (вероятно, в связи с высокой аффинностью к рецепторам прогестерона) [11]. В той или иной мере упомянутые физиологические процессы активируются всеми прогестинами и являются нормальной составляющей действия прогестерона. Некоторые из прогестинов или продуктов их биотрансформаций активируют другие типы стероидных рецепторов, вызывая нежелательные побочные эффекты. Рецептор андрогенов Андрогенные эффекты – один из основных побочных эффектов применения неселективных прогестинов или прогестинов в повышенных дозах. Используемые в настоящее время гестагены, помимо прогестагенного эффекта, могут вызывать умеренную вирилизацию (появление на лице волосяного пушка и др.). Дидрогестерон не приводит к активации рецептора андрогенов вследствие специфической адаптации всей структуры стероидсвязывающего домена рецептора к молекуле дидрогестерона [12]. Это изменение конформации приводит к дестабилизации комплекса дидрогестерон–рецептор и как следствие к отсутствию активации андрогеновых рецепторов дидрогестероном [2]. В настоящем исследовании показано, что активация андрогеновых рецепторов может модулировать транскрипцию около 250 генов. Применение метода анализа функциональной связи с использованием матрицы терминов, построенной на основании цитируемых ниже данных литературы, привело к идентификации 10 генов (табл. 3), активация которых может приводить к андрогенсвязанным побочным эффектам. Список генов в табл. 3 установлен посредством авторского метода анализа функциональной связи. Не для всех идентифицированных нами генов установлены вирилизирующие эффекты. Тем не менее для некоторых генов эта связь установлена. Так, белок PAX7 необходим для развития сфинктера уретры [13] и участвует во внутриклеточной передаче сигнала через каскады типа WNT. Каскады WNT важны для развития яичек [14] и вирилизации [15]. Белок пирин, кодируемый геном MEFV, является регулятором иммунитета, но также влияет на развитие гениталий [16]. Белковый продукт гена ANKH не только необходим для переработки фосфата, но также участвует в развитии предстательной железы [17]. Гидроксистероид дегидрогеназа 8 (ген HSD17B8) регулирует уровни эстрогенов и андрогенов и, как и другие белки биосинтеза стероидных гормонов (CYP21A2 [18], CYP11A1 [19], HSD3B2 [20]), неизбежно влияет на уровни андрогенов. В случае андрогеновых и рассматриваемых далее эстрогеновых рецепторов следует подчеркнуть, что для правильной половой дифференциации плода принципиальное значение имеет взаимодействие с этими рецепторами именно эндогенных андрогенов (у плода мужского пола) или эстрогенов (у плода женского пола). Любое экзогенное вмешательство (например, передозировка какого-либо прогестеронового препарата) неизбежно приведет к нарушению половой дифференцировки плода. Поэтому принципиальное значение имеют высокая селективность гестагенного препарата и полное отсутствие взаимодействия препарата или его метаболитов с рецепторами к тестостерону или эстрогенам. В среде детских эндокринологов, занимающихся проблемами нарушений пола, хорошо известно, что если любое вещество связывает андрогеновые рецепторы, это вещество не дает работать собственному, эндогенному тестостерону. Именно в этом случае и возникают аномалии развития репродуктивной системы плода. Эстрогеновые рецепторы Рецепторы эстрогена активируются основной формой эстрогена – 17b-эстрадиолом [21]. Формы ER-A и ER-B рецепторов имеют одинаковую структуру стероидсвязывающего домена. Расчет свободных энергий разных прогестинов (в том числе дидрогестерона) показал положительные значения относительной энергии образования комплекса гестоген–рецептор, из чего следует невозможность образования такого комплекса [2]. Однако прогестерон и некоторые другие прогестины будут трансформироваться внутри клеток, а продукты их трансфорации (прежде всего эстрадиол) будут взаимодействовать с эстрогеновыми рецепторами. В настоящем исследовании установлено, что активация эстрогеновых рецепторов может влиять на транскрипцию более 600 генов и анализ функциональной связи привел к идентификации более 20 генов (табл. 4), которые, по всей видимости, непосредственно влияют на феминизацию и гиперэстрогению при применении прогестинов, активирующих эстрогеновые рецепторы. Как показывают результаты проведенного полногеномного анализа, активация рецепторов эстрогенов затрагивает экспрессию ряда генов, имеющих прямое отношение к репродуктивной системе: гены, влияющие на развитие гениталий (PBX1, HOXD4, FGD1, TBX3) и поддержку специфических функций клеток репродуктивной системы (DIAPH2, SIX5, SPRY4, GNRH1). Белок Six5 необходим для выживания сперматид и сперматогенеза [22]. Белок DAAM1 участвует во внутриклеточной передаче сигнала через каскад WNT, которые важны для развития яичек [14, 23]. Следует особо отметить, что эстроген регулирует синтез гонадотропинсекретирующего гормона (ген GNRH1) – центрального репродуктивного гормона. Избыточная активация эстрогеновых рецепторов воздействует на уровни белков раннего развития плода (WNT3, DAAM1, WNT8A), что указывает на риск нарушений программы роста плода. Транскрипционные результаты активации трех исследованных типов рецепторов представлены на рис. 4. Заключение Ряд прогестинов, несмотря на их «естественное» происхождение и «полную аналогичность» прогестерону, могут вызывать побочные эффекты вследствие нежелательной активации непрогестероновых стероидных рецепторов. С использованием методов анализа всей последовательности генома человека в настоящей работе мы изучили различия в транскрипционных эффектах трех групп стероидных рецепторов: прогестеронового, андрогенового и эстрогенового. Каждый из этих рецепторов актвирует экспрессию многих сотен различных генов. Анализ позволил установить гены, активация которых стероидными рецепторами может значительно влиять на развитие плода в целом и репродуктивной системы плода в частности. В целом активация прогестероновых рецепторов будет управлять транскрипцией около 1800 генов, эстрогенового – транскрипцией около 600 генов, андрогенового – около 250 генов. Активация всех 3 рецепторов соответствует управлению транскрипцией более 2400 генов (около 10% всего генома человека). Применение неселективных прогестинов, повышенных доз прогестинов или прогестинов, метаболиты которых активируют эстрогеновые рецепторы, приведет к вмешательству в экспрессию всех этих 2400 генов. В то же время для поддержания беременности прогестерон активирует только около 1800 генов. Таким образом, селективность взаимодействия прогестинов со стероидными рецепторами – фундаментальный фактор, определяющий спектр побочных эффектов того или иного препарата. Следует еще раз подчеркнуть, что на развитие побочных эффектов влияет не только взаимодействие самого прогестина с рецепторами, но и биологическая активность метаболитов этого прогестина. В самом деле, даже сам прогестерон при избыточном его употреблении будет неизбежно вызывать побочные эффекты. Это обусловлено тем, что прогестерон является основным промежуточным продуктом в синтезе практически всех остальных стероидных гормонов и прежде всего эстрогенов и андрогенов. Следовательно, высокие дозы прогестерона будут увеличивать риск развития тех или иных нарушений развития плода вследствие систематических нарушений экспресии сотен генов. Поэтому необходимо использовать высокоселективные прогестины, которые активируют исключительно прогестероновые рецепторы и в то же время метаболически не преобразуются в агонисты андрогеновых или эстрогеновых рецепторов. Тем не менее использование даже высокоселективных прогестинов также должно соответствовать основному требованию клинической фармакологии: укладываться в диапазон апробированных в акушерстве эффективных, но безопасных доз.

About the authors

I Yu Torshin

O A Gromova

G T Sukhikh

S A Galitskaya

I S Yurgel'

References

Supplementary files