Особенности экспрессии маркеров пролиферации в гиперплазированном эндометрии

Полный текст

Введение В настоящее время проблема гиперплазии эндометрия (ГЭ) продолжает оставаться в центре внимания отечественных и зарубежных исследователей. Она актуальна как с позиций профилактики рака эндометрия, так и сохранения и восстановления репродуктивной функции у молодых социально активных женщин. Несмотря на достигнутые успехи, этиология и патогенез ГЭ до конца не изучены. Современный уровень развития молекулярной медицины позволяет проводить более объективную оценку состояния эндометрия. Это открывает возможности для выявления предикторов раковой трансформации эндометрия, использование которых могло бы способствовать оптимизации тактики ведения больных с ГЭ. Несмотря на то что традиционно ГЭ относят к числу пролиферативных состояний, результаты исследований по изучению маркеров пролиферации Ki-67 и PCNA (proliferating cell nuclear antigen) в гиперплазированном эндометрии достаточно противоречивы. В одних исследованиях выявлено увеличение экспрессии маркеров пролиферации, особенно при атипической ГЭ (АГЭ) и раке эндометрия [1, 2], по результатам других исследований ГЭ развивается на фоне низкой экспрессии Ki-67 и PCNA [3, 4]. Наиболее изученным является ген MKI67, кодирующий ядерный белок Ki-67, его рассматривают как «золотой стандарт» оценки пролиферативной активности клетки. Он отражает количество митотически активных клеток, так как экспрессируется во всех фазах клеточного цикла (G1, S, G2, M), кроме G0 [5]. За прохождение клетками М-фазы клеточного цикла отвечает белок, кодируемый геном CCNB1 (cyclin В1). Его избыточная экспрессия обнаружена при раке эндометрия [6]. По мнению некоторых авторов, к числу маркеров пролиферации можно отнести ген BIRC5 (baculoviral IAP repeat-containing protein 5) из группы ингибиторов апоптоза, принимая во внимание его регуляторное действие на клеточный цикл [7]. Известно, что белковый продукт гена-супрессора опухолевого роста PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10) участвует в регуляции клеточного цикла – подавляет пролиферацию клеток и стимулирует апоптоз. В результате генетических или эпигенетических воздействий может происходить инактивация гена PTEN, это сочетается со стимуляцией клеточной пролиферации [8]. Экспрессия гена PTEN наиболее изучена при неопластических изменениях эндометрия [9], вопрос о его прогностической роли при ГЭ остается недостаточно изученным. Таким образом, несмотря на достаточное число исследований, направленных на поиск молекулярно-генетических маркеров ГЭ, пока не представляется возможным выбрать наиболее информативные прогностические факторы формирования заболевания и его последующего развития. Цель исследования – определение экспрессии мРНК генов пролиферации и гена-супрессора опухолей PTEN при разных типах ГЭ и оценка возможности их применения в клинической практике. Материалы и методы Проведено клинико-морфологическое обследование 103 женщин с ГЭ (средний возраст – 44,2±4,6 года, средний индекс массы тела – ИМТ – 28,6±4,6 кг/м2), 62,4% из них находились в репродуктивном возрасте, остальные – в пременопаузе. Основная группа была разделена на подгруппы в соответствии с типом ГЭ (по классификации Всемирной организации здравоохранения) [10]: в 1-ю были включены 70 пациенток с простой ГЭ (ПГЭ), 2-ю – 18 с комплексной ГЭ (КГЭ), 3-ю – 15 с АГЭ (во всех случаях комплексной). Контролем послужили образцы эндометрия фазы пролиферации (n=26) и секреции (n=21), полученные от здоровых женщин репродуктивного возраста без воспалительных заболеваний органов малого таза и внутриматочной патологии. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинаталогии им. акад. В.И.Кулакова» Минздрава РФ. Операционно-биопсийный материал подвергали стандартной проводке на гистопроцессоре и заливке в парафиновые блоки. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Определение экспрессии мРНК генов пролиферации методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с предварительной стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) было проведено на 105 образцах ткани эндометрия, из них 31 – ПГЭ, 15 – КГЭ, 12 – АГЭ, 26 – эндометрий стадии пролиферации и 21 – секреции. Измерение уровней экспрессии мРНК генов MKI67, CCNB1, BIRC5, PTEN и 4 референсных генов B2M, TBP, GUSB, HPRT1 проводилось методом ОТ-ПЦР согласно инструкции (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Взятие материала осуществлялось аспирационной кюреткой Пайпель Де Корнье в пробирке со средой для стабилизации РНК. Экспрессию каждого гена определяли в двух повторах с последующим вычислением средних значений пороговых циклов (Cq). Для количественной оценки уровня экспрессии мРНК генов использовали метод сравнения индикаторных циклов (DDСq) c нормировкой по референсным генам и медиане значений уровня экспрессии гена в контрольной группе стадии пролиферации, которое было принято за 1 единицу. В качестве меры центральной тенденции всех количественных показателей использовали медиану (Me), в качестве интервальной оценки – нижний (0,25) и верхний (0,75) квартили. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводилось на образцах тканей, полученных от 67 пациенток, которые были разделены на следующие группы: 1-я (контрольная) – эндометрий поздней фазы пролиферации (n=11), 2-я – ПГЭ (n=23), 3-я – КГЭ (n=18), 4-я – АГЭ (n=15). ИГХ-выявление антигенов в парафиновых срезах иммунопероксидазным методом двойных антител с стрептовидин-биотиновым комплексом (Dako) проводилось по общепринятой методике. В качестве первичных антител были использованы моноклональные антитела к антигену Ki-67 (Dako) и PTEN (Dako). В качестве вторичных антител применяли биотинилированные антитела к иммуноглобулинам мыши и кролика (Dako LSAB + KIT, PEROXIDASE). Рабочая концентрация составила 1:100 и 1:200. Производилась постановка позитивных и негативных контрольных реакций. Оценка информативности полученных результатов ИГХ-исследования и ОТ-ПЦР проводилась непараметрическим методом с помощью U-критерия Манна–Уитни. Коэффициент ранговой корреляции определяли по методу Спирмена. Результаты исследования Выявлены морфологические особенности разных типов ГЭ. При ПГЭ ( рисунок, а), диагностированной у 70 пациенток, слизистая тела матки характеризовалась многочисленными неравномерно распределенными железами разной формы и величины, включая кистозно-расширенные, на отдельных участках со слабо выраженными складками в направлении просвета желез. Железистый эпителий структурно отличался от эпителия желез эндометрия стадии пролиферации, определялось значительное количество цитогенной стромы. На отдельных участках эндометрия в поверхностных отделах имелись расширенные сосуды (капилляры и венулы). КГЭ (аденоматозная; рисунок, б) была диагностирована у 18 пациенток. В отличие от ПГЭ она характеризовалась структурной перестройкой железистого компонента: среди многочисленных компактно расположенных желез разной формы и величины преобладали «ветвящиеся» со складчатостью в направлении просвета железы. Железистый эпителий многорядный, митотическая активность вариабельная. В строме, богатой фибробластоподобными клетками, местами рассеянная инфильтрация лимфоцитами, на отдельных участках – отек. Кровеносные сосуды распределены неравномерно, местами с фибриновыми тромбами, в поверхностном отделе эндометрия с расширенным просветом, явлениями стаза. Структурно-функциональные особенности эпителия при ПГЭ и КГЭ были похожими, отличались лишь конфигурацией маточных желез. В 15 случаях была выявлена комплексная АГЭ (рисунок, в), характеризующаяся преобладанием железистого компонента над стромальным, наличием атипии эпителиальных клеток, компактным расположением желез причудливой формы с пальцеобразными инвагинациями в направлении их просвета и наличием микропапиллярных формирований. В единичных железах отмечена тенденция к формированию «эпителиальных перемычек». Железистый эпителий многорядный с потерей полярности, наличием базальной мембраны, митотическая активность вариабельная, патологические митозы. Кровеносные сосуды тонкостенные, часть из них с фибриновыми тромбами. Проведена параллель между морфологическими типами ГЭ и основными клиническими характеристиками, представленными в табл. 1. Выявлено, что ПГЭ и КГЭ клинически схожи, для них характерны маточные кровотечения, возникающие после задержек менструаций. Существенных различий по возрасту, ИМТ, частоте пролиферативных процессов миометрия не обнаружено (p>0,05). Как видно из данных, приведенных в табл. 1, АГЭ по сравнению с ПГЭ и КГЭ выявлялась у женщин более молодого возраста, в каждом третьем случае не имела клинической манифестации, формировалась на фоне регулярного ритма менструаций (p<0,05). В этих случаях показаниями к проведению гистероскопии и раздельного диагностического выскабливания были результаты ультразвукового исследования, ановуляторное бесплодие. Вышесказанное говорит о сложности диагностики АГЭ. Результаты уровней экспрессии мРНК генов пролиферации и гена-супрессора опухолевого роста PTEN при разных типах ГЭ и в морфологически не измененном эндометрии отражены в табл. 2. Экспрессия мРНК генов MKI67, CCNB1, BIRC5 была снижена при всех типах ГЭ по сравнению с пролиферативным эндометрием и повышена по сравнению с эндометрием стадии секреции. Использование метода ОТ-ПЦР не позволило выявить достоверных различий в экспрессии изученных генов между разными типами ГЭ. При АГЭ отмечена тенденция к возрастанию экспрессии CCNB1, BIRC5. Полученные данные указывают на отсутствие различий в экспрессии мРНК гена PTEN в образцах эндометрия стадии пролиферации, секреции и разных типах ГЭ (см. табл. 2). Изучение экспрессии маркера пролиферации Ki-67 и гена-супрессора опухолевого роста PTEN проводилось также методом ИГХ. Выявлен высокий уровень экспрессии белка Ki-67 в эпителии эндометрия поздней фазы пролиферации – 68% и при АГЭ – 58% (рисунок, г). Наименьший уровень экспрессии Ki-67 обнаружен в эпителии клеток при ПГЭ – 13% и КГЭ – 14% (рисунок, д, е). Выявлены различия пролиферативной активности в строме и паренхиме при разных типах ГЭ: при ПГЭ преобладает пролиферативная активность стромального компонента над эпителиальным, при КГЭ – пролиферативная активность эпителиального компонента над стромальным. Экспрессия Кi-67 возрастает как в строме, так и в железах эпителия в ряду ПГЭ, КГЭ, АГЭ. При ИГХ-исследовании в эпителии желез эндометрия поздней стадии пролиферации выявлена 100% экспрессия PTEN, в строме содержание PTEN-позитивных клеток составило 65%. В эпителии желез при ПГЭ и КГЭ количество PTEN-позитивных эпителиальных клеток составило 96 и 97,88%, в стромальных клетках – 88,45 и 87,38% соответственно, что практически не отличалось от нормального эндометрия. При АГЭ установлено уменьшение PTEN-позитивных клеток в эпителии желез до 79,43% (p<0,05), строме – до 58,57% по сравнению с эндометрием стадии пролиферации. Обсуждение Клиническое течение ГЭ разнонаправленное – от спонтанной регрессии до развития рака эндометрия. В связи с этим в течение последних десятилетий идет поиск молекулярно-генетических предикторов развития и прогрессирования ГЭ. Это направление представляется интересным с научной и практической точек зрения. Поэтому было выполнено данное научное исследование, посвященное изучению маркеров пролиферации при разных типах ГЭ, на новом методологическом уровне. Дополнительно проводилась оценка экспрессии ряда маркеров методом ИГХ в строме и железах. Полученные результаты свидетельствуют о значительно более высоких уровнях MKI67, CCNB1 и BIRC5 в пролиферативном, чем в секреторном эндометрии. Это подтверждает данные о циклических изменениях упомянутых показателей во время нормального менструального цикла и указывает на их гормональную регуляцию [7, 11, 12]. Полученные данные о снижении экспрессии изученных маркеров пролиферации при разных типах ГЭ по сравнению с эндометрием стадии пролиферации соответствуют результатам многих исследований [1, 4, 13]. Обращает на себя внимание тот факт, что при ГЭ низкая пролиферативная активность по отношению к эндометрию стадии пролиферации и высокая относительно стадии секреции. Это дает возможность высказать предположение, что ГЭ занимает некое промежуточное состояние. Не исключено, что назначение прогестагенов во II фазу цикла позволит снизить пролиферативную активность до целевых значений – уровня стадии секреции. Важно отметить, что результаты исследований относительно пролиферативной активности при разных типах ГЭ противоречивы, ряд авторов указывают на повышение маркеров пролиферации при АГЭ [2, 14]. Как уже говорилось, методом ОТ-ПЦР не получено достоверных различий в экспрессии маркеров пролиферации между разными типами ГЭ. Однако ИГХ-метод выявил достоверное повышение экспрессии Ki-67 при АГЭ, что было уже отмечено ранее [15]. Разница в полученных данных может быть обусловлена методологическими различиями, так как определение мРНК генов производится в гомогенате эндометрия без подразделения на железы и строму, как это происходит при ИГХ-исследовании. В связи с этим трудно диагностировать локальные изменения, которые характерны для предраковых изменений эндометрия. Это наглядно прослеживается по результатам оценки экспрессии PTEN. Методом ОТ-ПЦР различий по всем изученным показателям выявить не удалось, тогда как ИГХ-метод дал возможность обнаружить экспрессию PTEN только в 75% клеток эпителия желез и 52% клеток стромы при АГЭ. Предположительно этим обусловлена некоторая разница в полученных результатах. Так как потеря экспрессии PTEN при АГЭ носит локальный характер, возможно, в связи с этим методом ОТ-ПЦР не выявлено снижение его экспрессии. Заключение Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что ГЭ формируется на фоне нарушенной клеточной пролиферации, сниженной по отношению к стадии пролиферации и повышенной по отношению к стадии секреции. Однако нарушение процессов пролиферации, вероятно, не является определяющим звеном в генезе ГЭ. По результатам пилотного исследования можно сделать предположение, что определение экспрессии мРНК маркеров пролиферации методом ОТ-ПЦР может позволить проводить дифференциальную диагностику между эндометрием стадий пролиферации, секреции и ГЭ. Дальнейшие исследования позволят детализировать роль разных механизмов в формировании ГЭ. Работа частично поддержана государственным контрактом Министерства образования и науки РФ от 22.02.2011 №16.512.11.2093

Об авторах

Мадина Равилевна Думановская

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава РФ, Москва

Email: m_dumanovskaya@oparina4.ru
аспирант отд-ния гинекологической эндокринологии ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И.Кулакова

Галина Евгеньевна Чернуха

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава РФ, Москва

Email: g_chernukha@oparina4.ru
д-р мед. наук, проф., рук. отд-ния гинекологической эндокринологии ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И.Кулакова

Ольга Владимировна Бурменская

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава РФ, Москва

Email: o_bourmenska@mail.ru
канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И.Кулаков

Оксана Сергеевна Непша

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава РФ, Москва

Email: o_nepsha@oparina4.ru
мл. науч. сотр. лаб. молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И.Кулакова

Станислав Владиславович Павлович

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава РФ, Москва

Email: s_pavlovich@oparina4.ru
канд. мед. наук, ученый секретарь ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И.Кулакова

Евгения Алтаровна Коган

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава РФ, Москва

Email: e_kogan@oparina4.ru
д-р мед. наук, проф., рук. 1-го патологоанатомического отд-ния ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И.Кулаков

Дмитрий Юрьевич Трофимов

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава РФ, Москва

Email: d_trofimov@oparina4.ru
д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И.Кулакова

Список литературы

Дополнительные файлы