Molekulyarno-geneticheskie aspekty protsessa implantatsii u patsientok programmy ekstrakorporal'nogo oplodotvoreniya (obzor literatury)

Full Text

Неудачи имплантации и преэмбрионические потери остаются серьезной проблемой программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и составляют около 85% от общего числа потерь беременностей, в то время как самопроизвольное прерывание беременности на ранних сроках происходит примерно в 15% [31]. Следует отметить, что 2 из 3 циклов ЭКО не приводят к беременности и более 8 из 10 перенесенных эмбрионов не имплантируются [24]. Однако эти цифры могут не отражать реальную частоту репродуктивных потерь. Повторные неудачи имплантации (ПНИ) определяют как отсутствие имплантации (беременности) при не менее 3 последовательных циклах ЭКО, в каждом из которых переносили 1–2 эмбриона высокого качества [35]. Большинство исследователей сходятся в том, что при переносе морфологически качественных эмбрионов одной из значимых причин неудач программ вспомогательных репродуктивных технологий является нарушение рецептивности эндометрия [9]. Рецептивность эндометрия (от англ. receptivity – восприимчивость, чувствительность) определяют как комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с четкими временными и пространственными константами, определяющими способность эндометрия к имплантации [3]. Восприимчивость эндометрия имеет важное значение для имплантации эмбриона, и, следовательно, ее изучение является одной из основных задач для исследователей в области репродуктивной медицины. Для понимания механизмов возникновения неполноценной имплантации и выявления факторов риска нарушений рецептивности эндометрия применяются разные методы оценки состояния эндометрия. Методы оценки В течение многих десятилетий критерии временных гистологических изменений, происходящих в его функциональном слое на протяжении 28-дневного менструального цикла, описанные в начале 1950-х годов в работе R.Noyes и соавт., являлись «золотым стандартом» для оценки рецептивности эндометрия и выявления его патологических изменений. Метод сканирующей электронной микроскопии остается основным для изучения пиноподий – выпячиваний мембраны на апикальной поверхности эпителиальных клеток эндометрия диаметром ~6 мкм, образующихся под действием прогестерона, которые в течение длительного времени рассматриваются в качестве ключевых морфологических маркеров рецептивности эндометрия [22]. Считается, что появление пиноподий в естественном цикле ограничивается коротким периодом в течение нескольких дней, что соответствует предполагаемому «окну имплантации», в то время как в циклах стимуляции суперовуляции пиноподии появляются на 1–2 дня раньше. Другие авторы считают, что пиноподии присутствуют на протяжении средней и поздней фаз секреции, претерпевая циклические морфологические изменения [38]. Появление пиноподий в середине лютеиновой фазы ассоциировано с увеличением секреции прогестерона и экспрессией лейкемия-ингибирующего фактора (LIF), рецептора LIF (LIF-R), интегрина V3, эпидермального фактора роста (EGF), глутаредоксина, что предполагает их непосредственное участие в процессе имплантации, в то время как блокирование экспрессии HОХА10 резко уменьшает количество пиноподий [29]. По данным литературы, присутствие пиноподий в лютеиновой фазе варьирует от нескольких часов до недели, поэтому логично предположить, что пиноподии могут очертить короткий период восприимчивости эндометрия (не более чем в течение 48 ч). Парадоксально, но эндометрий пациенток с бесплодием часто характеризуется присутствием пиноподий, поэтому на сегодняшний день значение гистологической структуры эндометрия в установлении причин неудач имплантации поставлено под сомнение и должно дополняться другими методами исследования. Наиболее разносторонне оценить состояние эндометрия возможно при использовании современных иммуногистохимических методов исследования, позволяющих определить динамику ядерной экспрессии стероидных рецепторов клеток в поверхностном эпителии, железах и строме в биоптатах эндометрия в зависимости от фазы менструального цикла, а также экспрессию факторов роста, цитокинов и компонентов межклеточного вещества. Полноценная имплантация обеспечивается за счет равновесия в понижении и повышении экспрессии разных генов в эндометрии под контролем стероидных гормонов, паракринных и эндокринных факторов регуляции. На данном этапе развития фундаментальной медицины интерес исследователей сконцентрирован на изучении широкого спектра потенциальных маркеров рецептивности эндометрия [4, 12, 27]. Предложены многие кандидатные маркеры, в том числе интегрины, гликоделины, LIF, HOXA-гены, гепаринсвязывающий фактор, подобный эпидермальному фактору роста (HB-EGF), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), колониестимулирующий фактор (СSF), интерлейкин (IL)-15 и др. [10]. Тем не менее ни один из них не является универсальным маркером рецептивности эндометрия и не был успешно использован в клинической практике. Так, исследование P.Brinsden и соавт. продемонстрировало отсутствие улучшения исходов ЭКО после введения рекомбинантного LIF в период после переноса эмбрионов женщинам с ПНИ [32]. Возможно, мы никогда не сможем понять сложный процесс имплантации с узкой направленностью одного гена, так как его регуляция обеспечивается экспрессией многих факторов, взаимодействующих друг с другом и образующих каскад молекулярных и клеточных сигналов. Эндометрий в течение менструального цикла претерпевает сложную серию последовательных пролиферативных и секреторных изменений под воздействием меняющихся концентраций эстрогенов и прогестерона. Главными особенностями ткани эндометрия в течение первой фазы являются активная пролиферация и ангиогенез, обеспечивающие развитие новой ткани, подавляющей факторы апоптоза. Секреторная трансформация сопровождается каскадом экспрессии ряда молекул, которые способствуют или, напротив, препятствуют имплантации эмбриона. Имплантация Процесс имплантации состоит из трех стадий: аппозиции, адгезии, инвазии. Во время стадии аппозиции эмбрион некоторое время находится во взвешенном состоянии у места вероятного прикрепления. Возможно, в это время происходит обмен сигнальными молекулами между трофобластом и эпителием матки, в ходе которого решается возможность дальнейшего «диалога». В фазу адгезии происходит непосредственный контакт эмбриона с эпителием и его фиксация на поверхности эндометрия. Третья стадия заключается в инвазии клеток трофобласта в эпителий и прорастании в строму, сопровождающихся ремоделированием сосудов эндометрия, активным процессом неоангиогенеза, что обеспечивает адекватное кровоснабжение развивающегося эмбриона и в дальнейшем – установление толерантности иммунной системы матери к плоду. Имплантация возможна только в течение ограниченного временного периода, возникающего между 6 и 10-м днем после пика лютеинизирующего гормона [11]. В течение этого периода, а именно «окна имплантации», эндометрий имеет характерное морфологическое и функциональное состояние, инициированное стероидными гормонами, которые в свою очередь регулируют экспрессию локально действующих цитокинов и хемокинов, факторов роста и транскрипции [37]. Предполагают, что нарушение нормальной экспрессии и действия этих молекул может приводить к неудачам имплантации, преэмбрионическим потерям, прерыванию беременности и нарушениям плацентации. Одними из таких специфических молекул, обеспечивающих взаимодействие клеток между собой и элементами межклеточного матрикса, являются молекулы адгезии. Семейство молекул клеточной адгезии представлено четырьмя группами, а именно интегринами, кадгеринами, селектинами и иммуноглобулинами. Интегрины являются наиболее изученной группой молекул клеточной адгезии в эндометрии и представляют собой семейство гетеродимерных белков, молекула которых состоит из нековалентно связанных a- и b-субъединиц. Интегрины обеспечивают взаимодействие клеток трофобласта с составляющими базальной мембраны и внеклеточного матрикса. В эндометрии человека на 20–24-й день экспрессируются три интегрина: a1b1, a4b1, anb3, но только увеличение экспрессии мРНК b3-субъединицы происходит после 19-го дня и не выявляется ранее. Низкий уровень интегрина anb3 ассоциирован с бесплодием неясного генеза, недостаточностью лютеиновой фазы, эндометриозом, гидросальпинксом, синдромом поликистозных яичников [8]. Известно, что интегриновые молекулы связываются друг с другом с помощью лигандов. Соединение интегрина anb3 с лигандом остеопонтином потенцирует начало инвазии трофобласта. В течение секреторной фазы остеопонтин является продуктом секреции эндометриальных желез [13]. Вместе с тем J.Herington и B.Bany обнаружили, что основной локализацией остеопонтина является субпопуляция натуральных киллеров (NK-клеток) во время децидуализации эндометрия [19]. Муцины Естественным барьером для имплантации эмбриона является наличие слоя гликокаликса, являющегося разновидностью муцина (MUC)-1, покрывающего поверхность клеток эпителия. MUC – семейство гликопротеинов c высокой молекулярной массой (200–500 кД), значительным содержанием углеводов и необычным аминокислотным составом с присущим ему высоким содержанием серина, треонина и пролина [4]. Среди 19 MUC человека только MUC-1 и в меньшей степени MUC-6 были найдены в эндометрии. MUC-1 – прогестеронзависимый интегральный мембранный белок, экспрессирующийся на поверхности эпителиоцитов. Уровень мРНК MUC-1 в эндометрии повышается от пролиферативной к секреторной фазе и снижается в позднюю секреторную фазу. MUC-1 предотвращает адгезию к поверхностному эпителию бластоцисты, не отвечающей нормальным характеристикам. В то же время повышенная экспрессия MUC-1 в эпителиальных клетках маточных труб в лютеиновой фазе обеспечивает защитный механизм против эктопической беременности [39]. После адгезии бластоцисты происходит паракринное ингибирование синтеза MUC-1 в месте имплантации. Факторы роста В течение преимплантационного периода важную роль играет присутствующий в эндометрии широкий спектр факторов роста. Факторы роста представляют собой биологически активные соединения, которые стимулируют или ингибируют деление и дифференцировку разных клеток и являются основными переносчиками митогенного сигнала клетки [1]. К наиболее изученным факторам роста относятся фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующие ростовые факторы (TGF)-a и TGF-b, СSF, EGF, фактор некроза опухолей a (TNF-a), VEGF и др. Инсулиноподобный фактор роста, связывающий протеин-1 (IGFBP-1), принадлежит к семейству инсулиноподобного фактора роста, продуцируется децидуальными стромальными клетками, стимулирует клеточную миграцию и адгезию и предотвращает избыточную инвазию трофобласта в миометрий матки. IGFBP-1 является антагонистом IGF-2, продуцируемого эмбрионом, избыток которого приводит к нерегулируемой инвазии трофобласта, лежащей в основе патогенеза трофобластических болезней и приращения плаценты [2]. IGFBP-1, взаимодействуя с a5b1-интегрином, способствует дифференцировке стромы в децидуальные клетки. Семейство EGF включает в себя TGF-ba, HB-EGF, амфирегулин, бетацеллюлин, эпирегулин и нейрегулин. Эти факторы имеют важное значение в пролиферации и дифференциации в некоторых органах и ассоциированы с эмбриогенезом, дальнейшим развитием и имплантацией. Существует четыре специфических эпидермальных рецептора – human epidermal receptor 1 (HER1), HER2, HER3 и HER4, которые связываются с гомодимерами или гетеродимерами представителей семейства EGF. Рецептор HER1 способен связываться с HB-EGF и амфирегулином, в то время как рецептор HER4 связывается только с HB-EGF. Рецепторы HER1 и HER4 присутствуют в эпителии маточных труб и эндометрии [18]. EGF, являясь паракринным медиатором пролиферации, играет важную роль в инвазии трофобласта, стимулирует пролиферацию клеток эндометрия, взаимодействуя с эстрогеновыми рецепторами [26]. HB-EGF представляет собой трансмембранный белок, имеющий общие рецепторы с EGF и с TGF-a. Уровень HB-EGF-протеина повышается в эпителиальных клетках во время пролиферативной фазы и снижается во время секреторной, максимальная экспрессия HB-EGF в эпителии отмечается в середине секреторной фазы. Растворимая форма HB-EGF увеличивает скорость хетчинга бластоцисты, активирует рост и развитие трофобласта, ингибирует апоптоз, стимулирует пролиферацию стромальных клеток [20]. TGF-b существует в трех разных изоформах: TGF-b1, TGF-b2 и TGF-b3. TGF-b белок и РНК локализованы в стромальных, эпителиальных и децидуальных клетках, причем экспрессия TGF-b2 более интенсивна в строме, в то время как TGF-b1 и TGF-b3 равны по интенсивности в стромальных и эпителиальных клетках. Только экспрессия TGF-b3 варьируется в зависимости от цикла, будучи более интенсивной в железистом эпителии в конце секреторной фазы TGF-bs оказывает воздействие на пролиферацию и дифференцировку клеток эндометрия, синтез компонентов экстрацеллюлярного матрикса и деградацию ферментов, являясь важным медиатором ремоделирования ткани. TGF-bs играет определенную роль в процессе имплантации через стимуляцию фактора роста сосудистого эндотелия и адгезии клеток трофобласта к экстрацеллюлярному матриксу [14]. TGF ингибирует секрецию хорионического гонадотропина, плацентарного лактогена, прогестерона и эстрадиола в клетках трофобласта. Сосудисто-эндотелиальный фактор Адекватное развитие сосудов обеспечивает функциональную подготовку эндометрия и его готовность к имплантации. Ангиогенез регулируется рядом ангиогенных активаторов, таких как оксид азота, матриксные металлопротеиназы (MMP), многие факторы роста, включая FGF, EGF и VEGF, которые являются ключевыми регуляторами проницаемости сосудов [40]. VEGF в наибольшей степени способствует проницаемости кровеносных сосудов и пролиферативной активности эндотелиальных клеток, подавляет апоптоз, стимулирует высвобождение оксида азота и простациклина из эндотелиальных клеток, что способствует вазодилатации [15]. Еndocrinegland VEGF экспрессируется в образцах эндометрия в периимплантационном периоде у пациенток репродуктивного возраста и редко обнаруживается в биоптатах женщин в постменопаузе и больных раком эндометрия. VEGF преимущественно экспрессируется в железистых эпителиальных клетках и диффузно – в строме, причем пик экспрессии приходится на середину секреторной фазы, что соответствует периоду развития ангиогенных свойств и максимальной пролиферативной активности клеток эндометрия. На ранних стадиях имплантации VEGF участвует в координации процессов дифференцировки, миграции и инвазии трофобласта. Локальная гипоксия и ишемия в тканях эндометрия, происходящая во время предменструального периода, является основным регулятором ангиогенеза и играет важную роль в синтезе VEGF. Фактор, индуцируемый гипоксией 1a, – транскрипционный фактор, в свою очередь стимулирует повышение экспрессии VEGF и других ангиогенных факторов в ответ на уменьшение содержания кислорода [21]. Лейкемия-ингибирующий фактор LIF, по данным большинства исследователей, – один из ключевых паракринных маркеров имплантации, имеющий важное значение во время аппозиции и адгезии бластоцисты. LIF обладает свойствами провоспалительного и гемопоэтического цитокина и частично дублирует биологические свойства IL-6, IL-11 и др. E.Dimitriadis и соавт. показали, что концентрация LIF в смывах из полости матки и образцах ткани эндометрия ниже у пациенток с бесплодием неясного генеза, а также у больных с безуспешными попытками ЭКО по сравнению с фертильными женщинами [6]. В свою очередь P.Serafini и соавт. сообщили, что у женщин с бесплодием с выраженной экспрессией LIF в середине лютеиновой фазы шансы на достижение беременности были в 6,4 раза выше, чем у пациенток со сниженной экспрессией LIF [12]. Повышенная экспрессия мРНК LIF обнаружена в популяции лимфоцитов децидуальной оболочки, которые накапливаются в большом количестве в месте имплантации; это позволяет предполагать, что LIF может опосредовать взаимодействие между материнскими децидуальными лимфоцитами и инвазией цитотрофобласта. Интерлейкин-6 IL-6 представляет собой многофункциональный цитокин, который играет важную роль в иммунном ответе, реакции острой фазы, кроветворении и может проявлять как про-, так и противовоспалительные свойства. IL-6 преимущественно экспрессируется в средней и поздней секреторной фазе, в то время как эндометрий подвергается воздействию стероидных гормонов, из чего можно заключить, что они могут регулировать его экспрессию [34]. В исследовании J.Sherwin и соавт. не было найдено различий в уровне IL-6 секреции в биоптатах эндометрия, полученных между 6 и 13-м днем после пика лютеинизирующего гормона у бесплодных женщин по сравнению с фертильными. В то же время M.Jasper и соавт. показали, что экспрессия в эндометрии IL-6 и IL-1 снижается в группе женщин с невынашиванием беременности неясного генеза по сравнению с фертильными женщинами [23]. Интерлейкин-15 IL-15 экспрессируется в стромальных и эпителиальных клетках эндометрия, децидуальной оболочке и плаценте. Его экспрессия в эпителиальных клетках выше, чем в стромальных в течение большей части цикла, повышение экспрессии в стромальных клетках наблюдается после децидуализации эндометрия. В своем исследовании N.Mariee и соавт. сравнили отношение уровней IL-15 и LIF c числом NK-клеток у 45 пациенток с ПНИ после ЭКО по сравнению с группой контроля (15 здоровых женщин) [27]. У женщин с ПНИ отмечались значительно более низкие уровни LIF в железистом эпителии эндометрия, увеличение экспрессии IL-15 в строме. Кроме того, была выявлена положительная корреляция между количеством NK-клеток в эндометрии и IL-15 в строме, по сравнению с фертильными женщинами, что позволяет предположить участие IL-15 в привлечении и пролиферации NK-клеток в эндометрии. Однако корреляции между экспрессией LIF и количеством NK-клеток отмечено не было. Семейство MMP Базальная мембрана – первый барьер, который преодолевает трофобласт, проникая в децидуализированную строму и прорастая в материнские кровеносные сосуды путем активации металлопротеаз и протеиназ, лизирующих компоненты внеклеточного матрикса. Этот процесс контролируется и ограничивается строго местом имплантации благодаря равновесию между секрецией металлопротеаз и их специфических ингибиторов – тканевых ингибиторов металлопротеаз, которые находятся под влиянием цитокинов и факторов роста. Семейство MMP представляет собой цинк- и кальцийзависимые эндопептидазы, которые по специфичности делятся на три группы: коллагеназы, желатиназы и стромелизины. У человека были выявлены 24 члена семейства MMP, являющиеся медиаторами деградации компонентов внеклеточного матрикса во время имплантации и децидуализации [17]. MMP играют ключевую роль во многих физиологических процессах, таких как морфогенез, эмбриональное развитие, ремоделирование ткани, а также при апоптозе, ангиогенезе, пролиферации, дифференциации и миграции клеток [5]. Простагландины (ПГ), относящиеся к группе эйкозаноидов, которая также включает простоциклины, тромбоксаны и лейкотриены, играют важную роль в разных репродуктивных процессах, таких как менструация, овуляция и имплантация [36]. Известны 2 изоформы циклооксигеназы (ЦОГ)-1 и 2, являющиеся важными ферментами, ответственными за синтез разных ПГ. ЦОГ-2, экспрессия которой регулируется стероидными гормонами, IL-1b, TNF-a и IFNg, играет важную роль в имплантации эмбриона и децидуализации через синтез ПГ [16]. ЦОГ-2 способствует синтезу ПГЕ2 из арахидоновой кислоты, который активирует ароматазу, переводящую андрогены в эстрогены [7]. Семейство HOX-генов HOX-гены («гены домашнего хозяйства»), кодирующие транскрипционные факторы, регулируют молекулярные и морфологические маркеры, экспрессируемые в период «окна имплантации», в том числе пиноподии, интегрин anb3, IGFBP-1, рецепторы ПГ. HOX-гены – необходимые регуляторы морфогенеза и дифференцировки тканей эмбриона – также имеют большое значение для роста эндометрия, дифференциации его клеток, рецептивности и децидуализации [25]. Увеличение экспрессии мРНК HOXA10 и HOXA11 происходит в эпителиальных и стромальных клетках эндометрия в среднюю и позднюю секреторную фазы, достигает пика во время «окна имплантации» и совпадает с высоким уровнем эстрогенов и прогестерона [33]. Кроме того, на ранних сроках беременности децидуальная оболочка продолжает экспрессировать высокие уровни мРНК HOXA10 и HOXA11. При таких заболеваниях, как гидросальпинкс, лейомиомы, эндометриоз, синдром поликистозных яичников, связанных с неудачами имплантации, происходит снижение экспрессии мРНК HOXA10 и HOXA11 в эндометрии. Для определения экспрессии большого количества генов при физиологических и патологических состояниях эндометрия в течение менструального цикла группой П.Роджерса было впервые предложено использование технологии микрочипов [28]. Авторы пришли к выводу, что можно характеризовать эндометрий в соответствии с его транскрипционным профилем, независимо от морфологических критериев. Более того, было установлено существование кластеров генов, экспрессия которых характерна для разных фаз цикла. Использование микрочипов в образцах биоптатов эндометрия позволяет оценить изменение профиля экспрессии генов, связанное с переходом невосприимчивого эндометрия в рецептивный [53]. Нарушение восприимчивости эндометрия у женщин с безуспешными попытками ЭКО, по данным литературы, может проявляться снижением экспрессии VEGF, LIF, интегрина anb3, HOXA10, HOXA11, IL-1, IL-11,TNF-a и повышением экспрессии IL-15, NK-клеток. Для таких цитокинов, как LIF, IL-6 и IL-18, необходима промежуточная концентрация. Так, повышение или понижение экспрессии отрицательно влияет на исходы имплантации. Заключение Таким образом, имплантация эмбриона – четко организованный процесс, который регулируется чрезвычайно сложным, постоянно меняющимся репертуаром молекул, вступающих в «игру» в свое время одна за другой, оставаясь в тесном сотрудничестве. Своевременная паракринная, аутокринная и интракринная регуляция экспрессии эмбриональных и эндометриальных факторов играет важную роль в определении судьбы эмбриона. С каждым годом список и роль разных молекул в регуляции имплантации расширяются. Однако, учитывая, что молекулярные маркеры для определения «идеального» периода восприимчивости эндометрия до сих пор не найдены, поиск потенциально информативных биомаркеров продолжается. По-видимому, не существует какого-то одного универсального маркера. Необходим комплексный подход, учитывающий множество факторов, что требует глубокого знания генных сетей, задействованных в процессах имплантации. Применение высоких технологий на геномных, транскриптомных и протеомных уровнях прольет больше света на процессы, происходящие в эндометрии, и добавит новые подходы к предотвращению неудач имплантации.

About the authors

Mayya Anatol'evna Okhrimenko

Dzhul'etta Artavazovna Khachaturyan

Veronika Yur'evna Smol'nikova

Andrey Evgen'evich Donnikov

References

Supplementary files