Новые возможности диагностики «малых» форм поражений эпителия шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией (обзор литературы)

Полный текст

Термин «lesser abnormalies» (малые поражения) ASCCP (American Society for Colposcopy and Cervical Pathology) рекомендует применять для обозначения цитологических заключений с атипичными плоскоэпителиальными клетками неопределенного типа (atypical squamous cells of undetermined significance - ASCUS), плоскоклеточным интраэпителиальным поражением низкой степени тяжести (low grade squamous intraepitelial lesion - LSIL) и при обнаружении ВПЧ-высокоонкогенных типов и/или персистенции ВПЧ-инфекции [3]. Тактика ведения именно этой группы женщин вызывает огромные споры. Невозможно предположить, какая часть пациенток окажется в группе высокого риска по прогрессированию заболевания, а у какой части произойдет элиминация ВПЧ-инфекции, приводящая к регрессу процесса. Известно, что в 10% случаев цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CIN) I может прогрессировать до CIN III и рака шейки матки (РШМ). Поэтому для многих врачей акушеров-гинекологов вопрос о тактике ведения пациентов разного возраста с «малыми» поражениями шейки матки и о целесообразности применения радикальных методов лечения остается нерешенным. ВПЧ и его жизненный цикл Взаимосвязь между развитием РШМ и наличием определенных типов вируса папилломы человека (ВПЧ) впервые была выявлена еще 30 лет назад H.Zur Hausen [11]. В результате проведенных эпидемиологических и молекулярно-генетических исследований было установлено, что основной причиной развития РШМ является инфицирование женщин высокоонкогенными типами ВПЧ [12, 13, 39, 40]. В настоящее время известны около 200 типов ВПЧ, из них полностью секвенированы более 150 типов, которые способны вызвать пролиферативные процессы в организме человека [4]. Согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV) все вирусы папилломы относятся к семейству Papillomaviridae, объединенных в 12 родов. Папилломавирусы человека представлены 5 филогенетическими группами: a-, b-, g-, m- и n-папилломавирусы. Данные группы схожи между собой в жизненном цикле, но различны в тропности тканей. Известно, что разные типы ВПЧ могут вызывать изменения в слизистой оболочке аногенитального тракта, верхних дыхательных путях и коже [10]. Деление родов на виды основано на различии нуклеотидной последовательности генома вируса. В частности, a-род состоит приблизительно из 30 типов ВПЧ, которые поражают слизистые оболочки половых путей, а также нескольких кожных типов ВПЧ. Данную группу подразделяют на 2 типа: ВПЧ-низкоонкогенные - вызывают доброкачественные изменения (остроконечными кондиломами), и ВПЧ-высокоонкогенные - являются главным фактором развития РШМ. В соответствии с международными эпидемиологическими исследованиями выделяют 18 высокоонкогенных типов ВПЧ, а именно: 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, и 82-й, связанные с развитием РШМ [13, 14]; 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, и 81-й типы ВПЧ не канцерогенные (низкоонкогенные). Представители b-папилломавирусов относятся к кожным типам ВПЧ и делятся на высокоонкогенные и низкоонкогенные типы. g-Папилломавирусы - тропны к эпителию кожи и очень редко вызывают ее раковые поражения. mu-, nu-Папилломавирусы обнаруживаются при доброкачественных образованиях кожи. Вирус папилломы представлен двухспиральной кольцевой структурой ДНК, включающий 8 тыс. пар нуклеотидов, и состоит из двух кодирующих областей, содержащих 8 открытых рамок считывания и 1 некодирующую или регуляторную область. Кодирующая область содержит ранние (Е1, Е2, Е4, Е5, Е6, Е7) и поздние (L1, L2) гены. Ранняя область включает гены Е1 и Е2, ответственные за репликацию вируса. Ген Е4 участвует в процессе созревания вирусных частиц, а гены Е5, Е6 и Е7 обладают трансформирующим потенциалом. Главными вирусными преобразующими генами являются Е6 и Е7, которые воздействуют на белки-супрессоры р53 и Rb, индуцирующие апоптоз. Установлено, что папилломавирусы могут инфицировать только незрелые делящиеся клетки (базальный/парабазальный слои). Внедрение ВПЧ происходит через микротравмы слизистой оболочки или на границе стыка двух эпителиев (цилиндрического и плоского). При половом акте микроскопические повреждения в наружной трети влагалища являются входными воротами для ВПЧ. Этим можно объяснить наибольшую частоту обнаружения патологически измененного эпителия на шейке матки в зоне трансформации и во влагалище. Вирусный геном может существовать как в эписомальной, так и в интегрированной форме. Пребывание вируса в эписомальном состоянии характеризуется наличием вирусных частиц в организме женщины без цитологических, кольпоскопических и гистологических проявлений. На этой стадии вероятность спонтанной ремиссии очень высока. В подавляющем большинстве случаев инфицирование не сопровождается появлением каких-либо серьезных патологических проявлений, и только у 1 из 100 инфицированных женщин развиваются клинические поражения [2]. Интегрированная форма характеризуется встраиванием последовательности ДНК ВПЧ в хромосому инфицированной клетки. Этот процесс является ключевым моментом запуска канцерогенеза. После проникновения внутрь эпителиальной клетки происходит высвобождение вирусного генома из оболочечных структур и перемещение его нуклеотидных кислот в ядро клетки. Центральную роль в процессе репликационного цикла играют белки Е6/Е7. Механизмы их действия лежат в основе развития болезни. Это видно при анализе онкобелков Е6/Е7 в норме и при инфицировании ВПЧ. Как известно, развитие злокачественного процесса происходит из-за нарушения внутриклеточных механизмов, которые на разных этапах своего развития приводят к молекулярно-генетическим изменениям, проявляющимся в нарушении дифференцировки и созревании клеток многослойного плоского эпителия шейки матки. Прохождение клеточного цикла в инфицированном вирусом эпителии не зависит от внешних ростовых факторов и стимулируется белками Е6 и Е7. Мишенями этих протеинов являются белки-супрессоры опухолевого роста - р53 и pRb (белок ретинобластомы). Белок p53 инициирует процессы апоптоза путем активации гена BAX и подавления гена BСL2. Установлено, что онкобелок Е6 вызывает деградацию белков-супрессоров гена р53 и апоптотических процессов, деградацию тирозинкиназы и активацию теломеразы. Взаимодействие Е7 с продуктами гена-супрессора Rb (р105, р107, р130) высвобождает фактор E2F и приводит к синтезу р16INK4А. Помимо этого Е7 влияет на выработку циклинов Е и А, D и cdk. В настоящее время наиболее изучены ВПЧ 16, 18, 31, 33, 58-го типов. В 50% случаев РШМ выявляется ВПЧ 16-го типа и в 20% случаев - ВПЧ 18-го типа [13, 15]. По данным литературы, в 70-80% случаев РШМ выявлено присутствие именно этих типов ВПЧ [8]. Известно, что у большинства женщин ВПЧ-инфекция носит транзиторный характер, в 70% случаев элиминация вируса происходит в течение первого года заражения и в 91% случаев - в течение 24 мес [18, 27, 38]. Предсказать исход инфицирования без анализа молекулярных маркеров невозможно. Известно, что длительная персистенция ВПЧ-высокоонкогенных типов может привести к развитию CIN. Поэтому всем ВПЧ-инфицированным пациенткам должна проводиться процедура генотипирования ВПЧ. Типирование на ВПЧ рекомендуют проводить в динамике с интервалами 1 раз в 6-12 мес. Методы диагностики ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки Для диагностики РШМ используются следующие методы исследования: цитологический, гистологический, расширенная кольпо-вульво-вагино-аноскопия, молекулярно-генетические (генотипирование ВПЧ с определением вирусной нагрузки, определение мРНК вирусных генов Е6/Е7, мРНК генов человека, микро-РНК - миРНК, метилирования генов), иммуноцитохимия. Цитологический тест позволяет выявить как диспластические поражения разной степени выраженности, так и инвазивный рак. В настоящее время, учитывая этиологическую роль ВПЧ в развитии дисплазии и РШМ, особое внимание уделяется классификации Бетесда. Терминологическая система Бетесда (Terminology Bethesda System - TBS) была принята в 1988 г. и в дальнейшем пересмотрена в 1991 и 2001 г. Ее значимость заключается в разделении цитологических мазков на три категории: норма (NILM); мазки неопределенного значения (ASCUS); внутриэпителиальные поражения низкой и высокой степени (LSIL, HSIL). Во многих странах используются классификации, модифицированные под свою специфику. Классификация по Папаниколау была разработана и официально внедрена в 1943 г. За последние 70 лет она неоднократно была пересмотрена и дополнена. Данная классификация имеет свои достоинства и недостатки. Во время ее внедрения в практику врачей-гинекологов о роли ВПЧ-инфекции ничего не было известно, поэтому она не учитывает цитологических изменений, вызванных ВПЧ (см. таблицу). American Cancer Society (ACS) и National Cancer Institute (NCI) рекомендуют ежегодный гинекологический осмотр женщин с периода «полового дебюта» с обязательным взятием мазка Папаниколау (ПАП-мазка). При наличии 3 или более цитологических заключений «норма» в дальнейшем забор ПАП-мазка у пациентки производится 1 раз в 3 года [41]. Широкое внедрение данного метода в практику существенно снизило уровень заболеваемости РШМ. Цитологическое исследование позволяет диагностировать только текущую клиническую и субклиническую формы инфекционного процесса. Предсказать ход развития процесса (прогресс/регресс) по цитологическим данным невозможно. Основным недостатком данного исследования является низкая чувствительность (от 40 до 70%) [30]. Характерным признаком папилломавирусной инфекции в цитологических мазках является наличие койлоцитов, а также клеток с признаками пара- и гиперкератоза [36]. Достоверность цитологического метода зависит от множества факторов: подготовки пациентки, правильного забора материала и его обработки. Немаловажную роль играет уровень подготовки специалистов, на которых лежит морфологический анализ цервикальных мазков. Известно, что скрининг, основанный только на данных цитологического мазка, может привести к ложноотрицательному диагнозу в 25% случаев [19, 21]. Обнаружение ДНК высокоонкогенных типов ВПЧ в эпителии шейки матки может служить прогностическим критерием возможного развития болезни. Проведенные исследования доказывают, что комбинация цитологического мазка с определением ДНК вируса является наиболее приемлемым методом в диагностике тяжелых дисплазий [22, 37]. Обнаружение ВПЧ способствует выявлению приблизительно на 50% больше CIN, чем мазок Папаниколау [20]. В 2000 г. Американским обществом по контролю за продуктами и лекарствами (Food and Drug Administration - FDA) был одобрен тест на выявление ВПЧ у женщин с цитологическим заключением ASCUS для принятия решения о необходимости проведения кольпоскопии. В апреле 2014 г. FDA рекомендовало проводить типирование ВПЧ всем женщинам с 25-летнего возраста как первоначальный этап программы по скринингу РШМ. Недавнее исследование в Индии продемонстрировало, что выявление ДНК ВПЧ уменьшает смертность от РШМ приблизительно до 50% [28]. Альтернативой ПАП-тесту является жидкостная цитология. К ее преимуществам относятся: низкая частота неадекватных мазков (уменьшение артефактов, связанных с фиксацией и хранением мазков); исследование всего полученного материала с возможностью до 6 одинаковых по клеточному составу образцов из одной цитологической системы; возможность ВПЧ-типирования; иммуноцитохимического исследования [р16(INK4a) и Ki-67] и ПЦР-исследования E6/E7 и других маркеров. Возможность типирования ВПЧ непосредственно из среды цитологического образца значительно облегчила работу врача [31, 33, 34]. Одним из факторов риска прогрессирования CIN считается высокая вирусная нагрузка. Ряд исследований показал, что высокая вирусная нагрузка на начальных этапах ВПЧ-инфекции свидетельствует о существенном риске прогрессирования заболевания до CIN III и выше, в сравнении с пациентами, у которых изначально концентрация ДНК ВПЧ была низкой [1, 5]. На основании данных мировой литературы были определены пороговые значения концентрации вируса в образцах: 3 логарифма (или 103) генома ВПЧ на 100 тыс. клеток человека - порог клинической значимости, 5 логарифмов геномов ВПЧ на 100 тыс. клеток (или 105) - порог прогрессии [6, 7]. Однако некоторые авторы считают, что степень вирусной нагрузки не отражает тяжесть поражения и не может служить диагностическим критерием [17]. Безусловно, доступным и простым методом диагностики поражения эпителия шейки матки является расширенная кольпоскопия, которая позволяет с помощью пробы с 3% раствором уксусной кислоты выявить изменения, характерные для ВПЧ-ассоциированных заболеваний. Эффективность данного метода зависит от состояния эпителия шейки матки и типа зоны трансформации. Так при при неудовлетворительной кольпоскопической картине (зона трансформации 2-3-го типа) метод мало информативен. При чувствительности 88,4% данный метод обладает низкой прогностической ценностью [35]. Его рутинное использование повышает частоту необоснованных биопсий. В настоящее время в клинической практике врача-гинеколога помимо стандартных методов исследования применяются молекулярные биомаркеры, которые отражают риск развития пролиферативных процессов с переходом в неоплазии. Их значимость весьма высока, но все же остается предметом дискуссии. Биомаркер (биологический маркер) - это исследуемый параметр, измерение которого отличается высокой точностью, надежностью и воспроизводимостью, что позволяет отражать напряженность физиологических процессов, состояние здоровья, степень риска или факт развития заболевания, его стадию и прогноз. Принимая во внимание факт увеличения частоты выявления цервикального рака в развивающихся странах, существует необходимость в выявлении новых маркеров для определения риска развития прогрессирования заболевания [16]. Известно, что интеграция вирусного генома в ядерный аппарат клетки хозяина приводит к выработке онкобелков Е6 и Е7. В норме Е7 не определяется в тканях. Его происхождение полностью связано с жизненным циклом интегративной формы ВПЧ-инфекции. J.Cuzick и соавт. в своем исследовании подтвердили, что непрерывное выделение онкобелков Е6/Е7 высокоонкогенных типов ВПЧ является основной причиной прогрессирования заболевания и развития РШМ [50]. Однако частота выявления мРНК Е6/Е7 была значительно меньше, чем частота обнаружения ДНК ВПЧ, что связано с регрессом инфекционного процесса и элиминацией ВПЧ [26, 51]. По данным литературы, прогностическая ценность теста с определением мРНК Е6/Е7 ВПЧ превышает прогностическую ценность повторной цитологии [9]. Ряд авторов предполагают, что выявление онкобелков Е6/Е7 у ВПЧ-позитивных женщин с цитологическим заключением ASCUS/LSIL может свидетельствовать о прогрессировании процесса [29, 44, 49]. Изучение уровней экспрессии молекулярно-генетических маркеров у пациенток с «малыми» поражениями эпителия шейки матки может иметь высокую прогностическую ценность в исходах данных заболеваний. В исследовании A.Tropé, K.Sjoborg и соавт. (2009 г.) изучена прогностическая значимость мРНК Е6/Е7 для ВПЧ 16, 18, 33 и 45-го типов. Результаты исследования показали, что обнаружение мРНК Е6/Е7 послужило индикатором повышенного риска прогрессии неопластических заболеваний шейки матки. Выявление уровня молекулярных маркеров продуктивной фазы наиболее значимо для прогнозирования исхода заболевания [25]. В Северной Норвегии используются тестовые системы по выявлению мРНК E6/E7 5 самых распространенных типов ВПЧ (16, 18, 31, 33 и 45-й типы), вызывающих РШМ. Аргументом в пользу выбора этого теста у пациенток с цитологическим заключением ASCUS/LSIL на фоне персистенции ВПЧ-высокоонкогенных типов послужило выявление группы пациенток, нуждающихся в проведении расширенной кольпоскопии, прицельной биопсии и незамедлительного хирургического лечения [9, 24]. Выявлено, что уровень мРНК Е6/Е7 положительно коррелирует с прогрессированием заболеваний шейки матки. Таким образом, порог уровня экспрессии мРНК Е6/Е7 обеспечивает разграничение нормальных цервикальных образцов и патологических клеток или тканей, а также образцов с цервикальными поражениями высокой степени (с тяжелыми дисплазиями) и образцов с низкой степенью поражения (легкими дисплазиями). В соответствии с этим уровни экспрессии мРНК Е6/Е7 и р16INK4А изменяются по мере нарастания тяжести поражения. Продолжительная продукция этих белков часто сопутствует переходу LSIL в HSIL и рак. Тем самым Е6/Е7 мРНК рассматривается как маркер определения риска развития тяжелых дисплазий. В поисках новых и важнейших биомаркеров патологии шейки матки были выявлены гены, характеризующие высокую частоту метилирования в измененных клетках. По данным N.Wentzensen и соавт., было проанализировано 68 разных генов метилирования у пациенток с ВПЧ-ассоциированными поражениями эпителия шейки матки. По результатам исследований было выделено 3 маркера (DAPK1, CADM1 и RARB), выявляемых вследствие аномального метилирования [42]. В настоящее время изолированное использование генов метилирования не может быть применено в диагностике прогрессирования заболевания. В процессе метилирования генов появляется белок р16(ink4a), отражающий генетическую нестабильность. Степень гиперэкспрессии р16(ink4a) пропорциональна тяжести SIL [43]. Доказано, что при тяжелых дисплазиях и РШМ чувствительность данного теста составляет 95%, специфичность - 96%. Таким образом, иммуноцитохимический тест на р16(ink4a) является информативным тестом для ранней диагностики РШМ. D.Schmidt и соавт. проанализировали уровень экспрессии p16 (INK4a) и Ki67 иммуноцитохимическим методом у пациенток с цитологическим заключением ASCUS и LSIL для обнаружения CIN2. Чувствительность p16 и Ki-67 составила 92,2% для пациенток с ASCUS и 94,2% - с LSIL; специфичность соответственно 80,6 и 68,0% [46]. Результаты исследования показали, что применение иммуноцитохимического теста на выявление p16/Ki-67 в цитологических мазках у пациенток с ASCUS/LSIL обеспечивает высокую чувствительность для выявления CIN2 [46, 47]. Одним из главных событий развития РШМ являются эпигенетические нарушения, связанные с инактивацией генов-супрессоров опухолевого роста. Изучение изменения уровня экспрессии мРНК генов человека у пациенток с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки для прогнозирования риска развития и прогрессирования CIN представляет большой интерес, однако исследования в данной области единичны. Так, в нашем проспективном исследовании с участием 225 женщин с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки были определены экспрессии мРНК генов MKI 67 (KI67), CTSL2, CDKN2A (P16), ESR1, PGR, BCL2, BAX, BAG1, CD68, SCUBE2, PTEN. Результаты проведенного исследования показали различия в уровне экспрессии мРНК потенциальных онкомаркеров в эпителии шейки матки у пациенток с цервикальными неоплазиями разной степени тяжести, РШМ и здоровых женщин. Повышение экспрессии мРНК генов MKI67 (KI67), CDKN2A (P16), снижение экспрессии PGR, BCL2 в сочетании с высокоонкогенными типами ВПЧ рассматриваются как возможные биомаркеры прогнозирования течения уже развившейся неоплазии; при ВПЧ-носительстве - как возможные биомаркеры прогнозирования развития неопластической трансформации эпителия шейки матки. Для диагностики, течения и прогнозирования ВПЧ-ассоциированнных поражений эпителия шейки матки изучаются миРНК. миРНК контролирует экспрессию генов на транскрипционном и посттранскрипционных уровнях, тем самым регулирует процесс канцерогенеза. Анализ многочисленных исследований выявления миРНК показал, что определенные типы миРНК влияют на гены-супрессоры опухолевого роста, процесс клеточного апоптоза. Выявление таких типов миРНК может быть маркером в ранней диагностике предраковых заболеваний и РШМ. Так, выявление miR-375 свидетельствует о прогрессировании заболевания с переходом в РШМ [45], а изменение экспрессии miR-25, -22, -92а и -29а более чем в 1,5 раза позволило предложить их в качестве диагностического маркера CIN разной степени тяжести и РШМ [48]. К сожалению, в настоящее время невозможно предсказать развитие заболеваний шейки матки у ВПЧ-позитивных женщин. Поэтому существует потребность в разработке и внедрении панели биомаркеров для выявления пациенток с высокой вероятностью прогрессирования заболевания и развития предрака и РШМ. Очень важно найти те маркеры, на основании которых будет возможно выявить группу с высоким прогностическим риском прогрессирования заболеваний у женщин с «малыми» формами поражения эпителия шейки матки. Исследование по изучению молекулярно-генетических маркеров, с помощью которых возможно спрогнозировать ход развития инфекционного процесса, сократит количество ненужных биопсий и поможет избежать отрицательных воздействий сверхдиагноза и последовательного сверхлечения у пациенток с «малыми» поражениями эпителия шейки матки [19, 20].

Об авторах

Н М Назарова

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава России

117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4

В Н Прилепская

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава России

Email: VPrilepskaya@mail.ru
117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4

Е Г Сычева

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава России

117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4

М Д Зардиашвили

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава России

117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4

О В Бурменская

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова Минздрава России

117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4

Список литературы

Дополнительные файлы