Рождение здорового ребенка в программе вспомогательных репродуктивных технологий после аутологичного сокультивирования эмбриона с клетками кумулюса и новой технологии переноса CAT. Клинический случай

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Кумулюсные клетки имеют важное значение во время роста и развития ооцитов, а также в процессе их созревания и оплодотворения. Результаты исследований показали, что сокультивирование эмбриона с аутологичными клетками кумулюса повышает частоту формирования бластоцист, а также улучшает эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Перенос эмбриона в таких программах рекомендовано осуществлять с помощью технологии САТ (Cumulus-Aided embryo Transfer), включающей в себя культивирование эмбриона на слое кумулюсных клеток и проведение переноса эмбриона с некоторым количеством разреженных клеток кумулюса. В отделение обратилась пациентка Г., 38 лет, с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 15 лет и несколькими неудачными попытками ВРТ в анамнезе. Пациентке была проведена программа ВРТ с использованием аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и новой технологии переноса CAT. У пациентки наступила беременность, закончившаяся своевременными оперативными родами. На момент написания публикации ребенок соматически здоров, развивается соответственно возрасту. Использование аутологичных клеток кумулюса в качестве источника биологически активных веществ способствует улучшению эмбриологического этапа, а также повышает частоту имплантации в программах ВРТ. Сокультивирование эмбриона с кумулюсными клетками особенно актуально пациентам с несколькими неудачными попытками ВРТ в анамнезе. Данная методика может стать достойной альтернативой для оптимизации системы культивирования эмбрионов человека в программах ВРТ.

Полный текст

Актуальность

Ведущая причина неэффективности лечения бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) заключается в нарушениях имплантации эмбриона [1]. Накопленный опыт показывает, что имплантация эмбриона контролируется сигнальными цитокинами, факторами роста и молекулами адгезии. В синтез данных соединений вовлечены клетки эндометрия, трофобласта и эмбриобласта эмбриона, а также окружающие ооцит клетки кумулюса [2]. Клетки кумулюса формируют непосредственное окружение ооцита и постоянно реагируют на изменения, происходящие в интрафолликулярной среде. Основная функция клеток кумулюса – регуляция транспорта энергетических субстратов в ооцит за счет оптимизации соотношения лактата/пирувата и регуляции концентрации уровня глюкозы и глутамина [3–5]. Нарушения молекулярно-биологического профиля в клетках кумулюса могут выступать одной из причин субоптимального ответа яичников на стимуляцию в программах ВРТ. В исследовании C. Karakaya и соавт. (2015 г.) показано, что «бедный» ответ на стимуляцию функции яичников ассоциирован с повышением уровня экспрессии микроРНК-21-5p в клетках кумулюса пациенток, проходящих лечение бесплодия методом ВРТ [6].

По данным European IVF Monitoring Consortium (EIM), доля интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) в программах ВРТ в европейских странах составляет 65% от всех выполняемых процедур оплодотворения [7]. Несмотря на очевидные преимущества данного способа оплодотворения, стоит отметить, что результаты некоторых исследований показали более низкую частоту формирования стадии бластоцисты у эмбрионов, полученных с помощью методики ИКСИ, по сравнению с экстракорпоральным оплодотворением [5, 8]. Вероятно, это связано с тем, что в ходе проведения ИКСИ необходимо ферментативное удаление клеток кумулюса с поверхности ооцита, таким образом, положительное воздействие этих клеток на дальнейшее развитие и качество эмбриона утрачивается. В нескольких исследованиях показана более высокая частота имплантации у пациентов при сокультивировании эмбриона на слое кумулюсных клеток и переносе эмбриона с небольшим количеством разреженных клеток кумулюса по сравнению с контрольной группой (25,6 и 14,5% соответственно) [9–11]. В исследовании P. Quinn и соавт. также обнаружено, что сокультивирование эмбриона с аутологичными клетками кумулюса приводит к более высокой частоте формирования бластоцист по сравнению со стандартными методиками культивирования (45 и 31% соответственно) [12]. Положительное влияние аутологичных кумулюсных клеток на доимплантационный потенциал эмбриона осуществляется за счет образования трипептида глутатиона и сульфиновой кислоты гипотаурина, которые нейтрализуют активные формы кислорода [13]. Кроме этого, клетки кумулюса образуют прогестерон, способствующий имплантации эмбриона.

Для более детального изучения механизмов влияния кумулюсных клеток на имплантационный потенциал эмбриона в исследовании M. Benkhalifa и соавт. (2012 г.) показано, что клетки кумулюса выступают экзогенным источником фактора ингибитора лейкозных клеток (LIF) и фактора активации рецепторов тромбоцитов (PAF-R) [14]. Данные ростовые факторы влияют на развитие эмбриона, бластуляцию, а также имплантацию бластоцисты за счет воздействия на фосфорилирование белков, включая тирозиновую киназу фокальных адгезий, участвующую в имплантации эмбриона [15]. Кроме этого, результаты некоторых исследований показали, что у мышей, нокаутированных по гену LIF и PAF-R, происходит нарушение имплантации бластоцисты [16].

Результаты исследований показали, что сокультивирование эмбриона с аутологичными клетками кумулюса может быть особенно эффективно у пациенток с множественными неудачными попытками ВРТ в анамнезе [9, 10]. Перенос эмбриона в таких программах ВРТ рекомендовано осуществлять с помощью технологии САТ (Cumulus-Aided embryo Transfer), включающей в себя культивирование эмбриона на слое кумулюсных клеток и проведение переноса эмбриона с некоторым количеством разреженных клеток кумулюса [17].

Несмотря на то что факторы, регулирующие имплантацию бластоцисты, до конца не изучены, результаты исследований дают основание предполагать, что сокультивирование аутологичных клеток кумулюса с эмбрионами человека не только позволяет увеличить частоту наступления беременности и рождения здоровых детей, но и улучшает системы культивирования эмбрионов человека in vitro [9, 12, 14, 18, 19]. В настоящей работе описан клинический случай аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и новой технологии переноса CAT у пациентки с несколькими неудачными попытками ВРТ в анамнезе. Результатом оптимизации эмбриологического этапа стало рождение здорового ребенка у супружеской пары с длительным бесплодием.

Описание клинического наблюдения

Пациентка Г., 38 лет, обратилась в отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия им. профессор Б.В. Леонова ФГБУ «НМИЦ АГП им. академик  В.И. Кулакова» Минздрава России с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 15 лет регулярной половой жизни без контрацепции. Из анамнеза: менструации с 15 лет, цикл регулярный, по 5 дней через 28 дней, без особенностей. Половая жизнь – с 15 лет, брак один. Супруг Г., 38 лет, соматически здоров, по данным спермограммы диагностирована тератозооспермия.

У пациентки в анамнезе были две самопроизвольные беременности, прерванные на малом сроке по социальным показаниям, без осложнений. В 2003 г. пациентке проведены лапароскопия, коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза, по данным хромосальпингоскопии – левая маточная труба непроходима, выполнена гистероскопия с раздельным диагностическим выскабливанием. По данным гистологического исследования обнаружена простая гиперплазия эндометрия, назначен курс агониста (ГнРГ) в течение 6 мес. В 2007 г. были проведены повторная лапароскопия, сальпингоовариолизис, сальпингостомия с обеих сторон, коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза, выполнены гистероскопия и раздельное диагностическое выскабливание, удален железисто-фиброзный полип эндометрия. В 2010 г. по данным гистеросальпингографии диагностирован двусторонний гидросальпинкс, проведены двусторонняя тубэктомия, а также удаление серозной цистаденомы правого яичника, послеоперационный период протекал без особенностей.

В 2011 г. пациентке по месту жительства была проведена первая программа ВРТ по протоколу с антагонистом ГнРГ (антГнРГ). Стимуляция функции яичников выполнялась препаратами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (р-ФСГ), начиная с 3-го дня менструального цикла. На 14-й день менструального цикла выполнена трансвагинальная пункция яичников (ТВП), получено 5 ооцитов, оплодотворение проведено методом ИКСИ. На 5-е сутки после оплодотворения выполнен перенос одного эмбриона в полость матки, без эффекта. В 2013 и 2015 гг. проведены повторные программы ВРТ по месту жительства по протоколу с антГнРГ, стимуляция функции яичников осуществлялась человеческим менопаузальным гормоном в суммарной дозе 1150 и 1350 МЕ соответственно. При проведении ТВП аспирировано 8 и 6 ооцитов, в обеих программах ВРТ оплодотворение полученных ооцитов выполнено методом ИКСИ, перенос одного эмбриона в полость матки проведен на 5-е сутки культивирования, беременность не наступила ни в одной программе ВРТ.

Учитывая наличие трех неэффективных программ ВРТ, у пациентки старшего репродуктивного возраста после подписания информированного добровольного согласия было решено провести лечение бесплодия методом ВРТ с использованием аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и новой технологии переноса САТ по протоколу с антГнРГ. У пациентки по данным ультразвукового исследования органов малого таза и гормонального обследования был сохраненный овариальный резерв (антимюллеров гормон – 1,15 нг/мл, ФСГ – 6,9 нг/мл, количество антральных фолликулов в обоих яичниках – 8–9). Стимуляция функции яичников проводилась с 4-го дня менструального цикла с помощью препарата человеческого менопаузального гормона и р-ФСГ в суммарной дозе 1650 МЕ. За 36 ч до ТВП назначен хорионический гонадотропин в дозе 8000 ЕД для финального созревания ооцитов.

На 13-й день менструального цикла проведена ТВП, аспирировано 4 ооцита. Эмбриологический этап проводили на одноступенчатых культуральных средах CSCM (США). Подготовка клеток кумулюса к сокультивированию проходила согласно методике, описанной в литературе [19], с модификациями, разработанными в ФГБУ «НМИЦ АГП им. академик  В.И. Кулакова» Минздрава России. После проведения оплодотворения методом ИКСИ ооциты были перенесены в культуральную среду CSCM. Спустя 14–16 ч в условиях эмбриологической лаборатории производилась оценка оплодотворения, которое считалось случившимся при появлении двух пронуклеусов и двух полярных телец. После 24 ч культивирования в среде клетки кумулюса превратились в фибробластоподобные клетки. Все этапы культивирования проводили в мультигазовых инкубаторах СООК (Австралия) в индивидуальных каплях по 25 мкл. В каждую каплю были добавлены клетки кумулюса, расчет их количества не проводился. Кумулюсные клетки занимали не более 1/4 капли. На 5-е сутки культивирования 2 эмбриона достигли стадии бластоцисты и соответствовали качеству 3АА и 3ВВ согласно классификации Gardner и соавт. Эмбрион отличного качества (3АА) был перенесен на 5-е сутки после оплодотворения с использованием новой технологии переноса CAT с небольшим количеством разреженных клеток кумулюса. Эмбрион среднего качества (3ВВ) был криоконсервирован на 5-е сутки культивирования. Поддержка посттрансферного периода осуществлялась с помощью микронизированного прогестерона в дозе 300 мг в сутки.

В результате проведенной программы ВРТ в стимулированном цикле наступила беременность. На 14-й день после переноса эмбриона уровень β-субъединицы хорионического гонадотропина человека составил 978 мМЕ/мл. В I триместре беременности пациентка была госпитализирована на сроке 12–13 нед с угрозой прерывания беременности, проводилась спазмолитическая, гемостатическая и гормональная терапия. Во II триместре беременности на сроке 19–20 нед проведена хирургическая коррекция истмико-цервикальной недостаточности путем наложения двух циркулярных швов на шейку матки. III триместр беременности протекал без особенностей, на сроке 38–39 нед беременности пациентка была родоразрешена путем операции кесарева сечения в связи с оболочечным прикреплением пуповины в области нижнего края плаценты и ухудшением состояния плода по данным допплерометрии. Родилась живая доношенная девочка, с оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов, массой тела 3070 кг, ростом 51 см, кровопотеря в родах составила 700 мл. На момент написания публикации ребенок соматически здоров, развивается соответственно возрасту.

Заключение

Результаты многих исследований показали, что сокультивирование эмбриона с аутологичными клетками кумулюса повышает результативность программ ВРТ за счет положительного влияния кумулюсных клеток на процессы раннего эмбриогенеза и имплантацию эмбриона [9, 12, 14, 18, 19]. Данная методика исключает использование гетерогенных клеток, не подразумевает избыточные финансово-экономические затраты, а также не занимает у эмбриолога много времени.

Клетки кумулюса в процессе сокультивирования выделяют различные ростовые факторы (LIF, PAF-R, EGF и VEGF), а также гормоны (прогестерон) и цитокины. Кроме этого, клетки кумулюса стимулируют гликолиз, аминокислотный транспорт, биосинтез стеролов в развивающемся эмбрионе, а также имеют важное значение в цитоплазматическом созревании ооцита. Стоит подчеркнуть, что после оплодотворения зигота в течение первых 3 сут остается транскрипционно неактивной. Только на этапе материнско-зиготического перехода происходит активация зиготического генома с одновременной активацией и подавлением нескольких тысяч генов [20]. До активации зиготического генома поддержание необходимого уровня белков и транскриптов для оптимального метаболизма эмбриона осуществляется только благодаря генетическому аппарату ооцита. Показано, что сокультивирование оплодотворенного ооцита с аутологичными клетками кумулюса поддерживает его функционирование в раннем эмбриональном периоде за счет детоксикации среды культивирования и секреции эмбриотропных веществ [21, 22]. Описанный клинический случай, а также результаты исследований подтверждают актуальность использования аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса в программах ВРТ у пациенток с несколькими неудачными попытками в анамнезе. Данная методика не только позволяет повысить способность оплодотворенных ооцитов к дальнейшему развитию в условиях in vitro, но и может стать достойной альтернативой для оптимизации системы культивирования эмбрионов человека в программах ВРТ.

 

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Работа выполнена в рамках финансирования государственного задания «Решение проблемы бесплодия в современных условиях путем разработки клинико-диагностической модели бесплодного брака и использования инновационных технологий в программах вспомогательной репродукции №121040600410-7».

Financing. The work was carried out with financing of the national research program “Solving the problem of infertility in modern conditions by developing a clinical and diagnostic model of infertility marriage and using innovative technologies in assisted reproduction programs №121040600410-7”.

×

Об авторах

Гунай Раисовна Асфарова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России

Email: asfarovag@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4653-1371

аспирант отд-ния вспомогательных технологий в лечении бесплодия

Россия, Москва

Вероника Юрьевна Смольникова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России

Email: v_smolnikova@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0002-8025-4849

доктор медицинских наук, вед. научный сотрудник отд-ния вспомогательных технологий в лечении бесплодия

Россия, Москва

Наталья Петровна Макарова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России

Email: np_makarova@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0003-1396-7272
SPIN-код: 8498-4890

доктор биологических наук, вед. научный сотрудник отд-ния вспомогательных технологий в лечении бесплодия

Россия, Москва

Юлия Сергеевна Драпкина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: yu_drapkina@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0002-0545-1607
SPIN-код: 6677-6540
Scopus Author ID: 1042760

кандидат медицинских наук, научный сотрудник отд-ния вспомогательных технологий в лечении бесплодия

Россия, Москва

Анастасия Павловна Сысоева

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России

Email: sysoeva.a.p@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6502-4498

эмбриолог отд-ния вспомогательных технологий в лечении бесплодия

Россия, Москва

Наталия Николаевна Лобанова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России

Email: n_lobanova@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0002-0818-4073

мл. научный сотрудник отд-ния вспомогательных технологий в лечении бесплодия

Россия, Москва

Елена Анатольевна Калинина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России

Email: e_kalinina@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0002-8922-2878

доктор медицинских наук, профессор, заведующий отд-нием вспомогательных технологий в лечении бесплодия

Россия, Москва

Список литературы

  1. Borght MV, Wyns C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clin Biochem. 2018;62:2-10. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2018.03.012
  2. Bongso A, Ng SC, Fong CY, Ratnam S. Cocultures: a new lead in embryo quality improvement for assisted reproduction. Fertil Steril. 1991;56(2):179-91. doi: 10.1016/s0015-0282(16)54468-9
  3. Сафронова Н.А., Калинина Е.А., Донников А.Е., и др. Перспективы исследования маркеров клеток кумулюса для оценки качества ооцитов и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2015;12:21-5 [Safronova NA, Kalinina EA, Donnikov AE, et al. Prospects for studying cumulus cell markers to assess the quality of oocytes and embryos in assisted reproductive technology programs. Akusherstvo i ginekologiya. 2015;12:21-5 (in Russian)].
  4. Ebert P, Völklein K. Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril. 2010;93(6):e25; author reply e26. doi: 10.1016/j.fertnstert.2009.12.048
  5. Ebner T, Moser M, Sommergruber M, et al. Incomplete denudation of oocytes prior to ICSI enhances embryo quality and blastocyst development. Hum Reprod. 2006;21(11):2972-7. doi: 10.1093/humrep/del272
  6. Karakaya C, Guzeloglu-Kayisli O, Uyar A, et al. Poor ovarian response in women undergoing in vitro fertilization is associated with altered microRNA expression in cumulus cells. Fertil Steril. 2015;103(6):1469-76.e1-3. doi: 10.1016/j.fertnstert.2015.02.035
  7. De Geyter C, Calhaz-Jorge C, Kupka MS, et al. ART in Europe, 2014: results generated from European registries by ESHRE: The European IVF-monitoring Consortium (EIM) for the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE). Hum Reprod. 2018;33(9):1586-1601. doi: 10.1093/humrep/dey242
  8. Van Landuyt L, De Vos A, Joris H, et al. Blastocyst formation in in vitro fertilization versus intracytoplasmic sperm injection cycles: influence of the fertilization procedure. Fertil Steril. 2005;83(5):1397-403. doi: 10.1016/j.fertnstert.2004.10.054
  9. Sapandorfer SD, Pascal P, Parks J, et al. Autologous endometrial coculture in patients with IVF failure: outcome of the first 1,030 case. J Reprod Med. 2004;49(6):463-7.
  10. Kattal N, Cohen J, Barmat LI. Role of coculture in human in vitro fertilization: a meta-analysis. Fertil Steril. 2008;90(4):1069-76. doi: 10.1016/j.fertnstert.2007.07.1349
  11. Eyheremendy V, Raffo FGE, Papayannis M, et al. Beneficial effect of autologous endometrial cell coculture in patients with repeated implantation failure. Fertil Steril. 2010;93(3):769-73. doi: 10.1016/j.fertnstert.2008.10.060
  12. Quinn P, Margalit R. Beneficial effect of coculture with cumulus cells on blastocyst formation in prospective trial with supernumerary human embryos. J Assist Reprod Genet. 1996;13(1):9-12. doi: 10.1007/BF02068862
  13. Асфарова Г.Р., Смольникова В.Ю., Макарова Н.П., и др. Аутологичное сокультивирование эмбрионов с клетками кумулюса в программах ВРТ. Акушерство и гинекология. 2018;11:10-4 [Asfarova GR, Smolnikova VYu, Makarova NP, et al. Autologous embryo-cumulus cell co-culturing in ART programs. Akusherstvo i Ginekologiya. 2018;11:10-4 (in Russian)].doi: 10.18565/aig.2018.11.10-14
  14. Benkhalifa M, Demirol A, Sari T, et al. Autologous embryo-cumulus cells co-culture and blastocyst transfer in repeated implantation failures: a collaborative prospective randomized study. Zygote. 2012;20(2):173-80. doi: 10.1017/S0967199411000062
  15. Vendrell-Flotats M, García-Martínez T, Martínez-Rodero I, et al. In vitro maturation in the presence of Leukemia Inhibitory Factor modulates gene and miRNA expression in bovine oocytes and embryos. Sci Rep. 2020;10(1):17777. doi: 10.1038/s41598-020-74961-6
  16. Mo C, Chearwae W, Bright JJ. PPARgamma regulates LIF-induced growth and self-renewal of mouse ES cells through Tyk2-Stat3 pathway. Cell Signal. 2010;22(3):495-500. doi: 10.1016/j.cellsig.2009.11.003
  17. Cihangir N, Görkemli H, Ozdemir S, et al. Influence of cumulus cell coculture and cumulusaided embryo transfer on embryonic development and pregnancy rates. J Turk Ger Gynecol Assoc. 2010;11(3):121-6. doi: 10.5152/jtgga.2010.017
  18. Levitas E, Lunenfeld E, Har-Vardi I, et al. Blastocyst-stage embryo transfer in patients who failed to conceive in three or more day 2–3 embryo transfer cycles: a prospective, randomised study. Fertil Steril. 2004;81(3):567-71. doi: 10.1016/j.fertnstert.2003.08.031
  19. Parikh F, Nadkarni SG, Naik NJ, et al. Cumulus coculture and cumulus-aided embryo transfer increase pregnancy rates in patients undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril. 2006;86(4):839-47. doi: 10.1016/j.fertnstert.2006.03.028
  20. Тимофеева А.В., Калинина Е.А., Драпкина Ю.С., и др. Оценка качества эмбриона по профилю экспрессии малых некодирующих РНК в культуральной среде эмбриона в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2019;6:79-86 [Timofeeva AV, Kalinina EA, Drapkina IuS, et al. Embryo quality assessment by the small noncoding RNA expression profile in an embryo culture medium in assisted reproductive technology programs. Akusherstvo i Ginekologiya. 2019;6:79-86 (in Russian)]. doi: 10.18565/aig.2019.6.79-86
  21. Lin YH, Hwang JL, Seow KM, et al. Effects of growth factors and granulosa cell co-culture on in-vitro maturation of oocytes. Reprod Biomed Online. 2009;19(2):165-70. doi: 10.1016/s1472-6483(10)60068-5
  22. Godard NM, Pukazhenthi BS, Wildt DE, Comizzoli P. Paracrine factors from cumulus-enclosed oocytes ensure the successful maturation and fertilization in vitro denuded oocytes in the cat model. Fertil Steril. 2009;91(Suppl. 5):2051-60. doi: 10.1016/j.fertnstert.2008.05.069.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© ООО "Консилиум Медикум", 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-63961 от 18.12.2015.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах