The birth of a healthy child in the assisted reproductive technologies program after autologous co-culture of embryo with cumulus cells and a new CAT transfer technology. Case report

Gunai R. Asfarova; Асфарова Гунай Раисовна; Veronika I. Smol'nikova; Смольникова Вероника Юрьевна; Natalia P. Makarova; Макарова Наталья Петровна; Iuliia S. Drapkina; Драпкина Юлия Сергеевна; Anastasiia P. Sysoeva; Сысоева Анастасия Павловна; Nataliia N. Lobanova; Лобанова Наталия Николаевна; Elena A. Kalinina; Калинина Елена Анатольевна

doi:10.26442/20795696.2021.3.200876

The birth of a healthy child in the assisted reproductive technologies program after autologous co-culture of embryo with cumulus cells and a new CAT transfer technology. Case report

Authors: Asfarova G.R.¹, Smol'nikova V.I.¹, Makarova N.P.¹, Drapkina I.S.¹, Sysoeva A.P.¹, Lobanova N.N.¹, Kalinina E.A.¹
Affiliations:
1. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology
Issue: Vol 23, No 3 (2021)
Pages: 270-274
Section: CLINICAL CASE
URL: https://gynecology.orscience.ru/2079-5831/article/view/76161
DOI: https://doi.org/10.26442/20795696.2021.3.200876
ID: 76161

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Cumulus cells are essential during oocytes growth and development, as well as during their maturation and fertilization. Research results have shown that embryo co-cultivation with autologous cumulus cells increases the frequency of blastocyst formation, and also improves the effectiveness of ART programs. Embryo transfer in such programs is recommended to be carried out using the CAT technology (Cumulus-Aided embryo Transfer), which includes embryo cultivation on a layer of cumulus cells and embryo transfer with a certain amount of diluted cumulus cells. Patient G., 38 years old, came to the department with infertility for 15 years and recurrent implantation failure in history. The patient had ART program with autologous co-cultivation of embryos with cumulus cells and a new CAT transfer technology. The patient fell pregnant and gave birth to a healthy child. Autologous cumulus cells can be a source of biologically active substances and improve embryological parameters and implantation rate in ART programs. Embryo co-cultivation with cumulus cells is especially important for patients with recurrent implantation failure. This technique can become an alternative for optimizing human embryos culturing.

Keywords

assisted reproductive technologies, cumulus cells, CAT technology, co-cultivation, growth factors, embryo, oocyte, embryo implantation, recurrent implantation failure

Full Text

Актуальность

Ведущая причина неэффективности лечения бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) заключается в нарушениях имплантации эмбриона [1]. Накопленный опыт показывает, что имплантация эмбриона контролируется сигнальными цитокинами, факторами роста и молекулами адгезии. В синтез данных соединений вовлечены клетки эндометрия, трофобласта и эмбриобласта эмбриона, а также окружающие ооцит клетки кумулюса [2]. Клетки кумулюса формируют непосредственное окружение ооцита и постоянно реагируют на изменения, происходящие в интрафолликулярной среде. Основная функция клеток кумулюса – регуляция транспорта энергетических субстратов в ооцит за счет оптимизации соотношения лактата/пирувата и регуляции концентрации уровня глюкозы и глутамина [3–5]. Нарушения молекулярно-биологического профиля в клетках кумулюса могут выступать одной из причин субоптимального ответа яичников на стимуляцию в программах ВРТ. В исследовании C. Karakaya и соавт. (2015 г.) показано, что «бедный» ответ на стимуляцию функции яичников ассоциирован с повышением уровня экспрессии микроРНК-21-5p в клетках кумулюса пациенток, проходящих лечение бесплодия методом ВРТ [6].

По данным European IVF Monitoring Consortium (EIM), доля интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) в программах ВРТ в европейских странах составляет 65% от всех выполняемых процедур оплодотворения [7]. Несмотря на очевидные преимущества данного способа оплодотворения, стоит отметить, что результаты некоторых исследований показали более низкую частоту формирования стадии бластоцисты у эмбрионов, полученных с помощью методики ИКСИ, по сравнению с экстракорпоральным оплодотворением [5, 8]. Вероятно, это связано с тем, что в ходе проведения ИКСИ необходимо ферментативное удаление клеток кумулюса с поверхности ооцита, таким образом, положительное воздействие этих клеток на дальнейшее развитие и качество эмбриона утрачивается. В нескольких исследованиях показана более высокая частота имплантации у пациентов при сокультивировании эмбриона на слое кумулюсных клеток и переносе эмбриона с небольшим количеством разреженных клеток кумулюса по сравнению с контрольной группой (25,6 и 14,5% соответственно) [9–11]. В исследовании P. Quinn и соавт. также обнаружено, что сокультивирование эмбриона с аутологичными клетками кумулюса приводит к более высокой частоте формирования бластоцист по сравнению со стандартными методиками культивирования (45 и 31% соответственно) [12]. Положительное влияние аутологичных кумулюсных клеток на доимплантационный потенциал эмбриона осуществляется за счет образования трипептида глутатиона и сульфиновой кислоты гипотаурина, которые нейтрализуют активные формы кислорода [13]. Кроме этого, клетки кумулюса образуют прогестерон, способствующий имплантации эмбриона.

Для более детального изучения механизмов влияния кумулюсных клеток на имплантационный потенциал эмбриона в исследовании M. Benkhalifa и соавт. (2012 г.) показано, что клетки кумулюса выступают экзогенным источником фактора ингибитора лейкозных клеток (LIF) и фактора активации рецепторов тромбоцитов (PAF-R) [14]. Данные ростовые факторы влияют на развитие эмбриона, бластуляцию, а также имплантацию бластоцисты за счет воздействия на фосфорилирование белков, включая тирозиновую киназу фокальных адгезий, участвующую в имплантации эмбриона [15]. Кроме этого, результаты некоторых исследований показали, что у мышей, нокаутированных по гену LIF и PAF-R, происходит нарушение имплантации бластоцисты [16].

Результаты исследований показали, что сокультивирование эмбриона с аутологичными клетками кумулюса может быть особенно эффективно у пациенток с множественными неудачными попытками ВРТ в анамнезе [9, 10]. Перенос эмбриона в таких программах ВРТ рекомендовано осуществлять с помощью технологии САТ (Cumulus-Aided embryo Transfer), включающей в себя культивирование эмбриона на слое кумулюсных клеток и проведение переноса эмбриона с некоторым количеством разреженных клеток кумулюса [17].

Несмотря на то что факторы, регулирующие имплантацию бластоцисты, до конца не изучены, результаты исследований дают основание предполагать, что сокультивирование аутологичных клеток кумулюса с эмбрионами человека не только позволяет увеличить частоту наступления беременности и рождения здоровых детей, но и улучшает системы культивирования эмбрионов человека in vitro [9, 12, 14, 18, 19]. В настоящей работе описан клинический случай аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и новой технологии переноса CAT у пациентки с несколькими неудачными попытками ВРТ в анамнезе. Результатом оптимизации эмбриологического этапа стало рождение здорового ребенка у супружеской пары с длительным бесплодием.

Описание клинического наблюдения

Пациентка Г., 38 лет, обратилась в отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия им. профессор Б.В. Леонова ФГБУ «НМИЦ АГП им. академик В.И. Кулакова» Минздрава России с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 15 лет регулярной половой жизни без контрацепции. Из анамнеза: менструации с 15 лет, цикл регулярный, по 5 дней через 28 дней, без особенностей. Половая жизнь – с 15 лет, брак один. Супруг Г., 38 лет, соматически здоров, по данным спермограммы диагностирована тератозооспермия.

У пациентки в анамнезе были две самопроизвольные беременности, прерванные на малом сроке по социальным показаниям, без осложнений. В 2003 г. пациентке проведены лапароскопия, коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза, по данным хромосальпингоскопии – левая маточная труба непроходима, выполнена гистероскопия с раздельным диагностическим выскабливанием. По данным гистологического исследования обнаружена простая гиперплазия эндометрия, назначен курс агониста (ГнРГ) в течение 6 мес. В 2007 г. были проведены повторная лапароскопия, сальпингоовариолизис, сальпингостомия с обеих сторон, коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза, выполнены гистероскопия и раздельное диагностическое выскабливание, удален железисто-фиброзный полип эндометрия. В 2010 г. по данным гистеросальпингографии диагностирован двусторонний гидросальпинкс, проведены двусторонняя тубэктомия, а также удаление серозной цистаденомы правого яичника, послеоперационный период протекал без особенностей.

В 2011 г. пациентке по месту жительства была проведена первая программа ВРТ по протоколу с антагонистом ГнРГ (антГнРГ). Стимуляция функции яичников выполнялась препаратами рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (р-ФСГ), начиная с 3-го дня менструального цикла. На 14-й день менструального цикла выполнена трансвагинальная пункция яичников (ТВП), получено 5 ооцитов, оплодотворение проведено методом ИКСИ. На 5-е сутки после оплодотворения выполнен перенос одного эмбриона в полость матки, без эффекта. В 2013 и 2015 гг. проведены повторные программы ВРТ по месту жительства по протоколу с антГнРГ, стимуляция функции яичников осуществлялась человеческим менопаузальным гормоном в суммарной дозе 1150 и 1350 МЕ соответственно. При проведении ТВП аспирировано 8 и 6 ооцитов, в обеих программах ВРТ оплодотворение полученных ооцитов выполнено методом ИКСИ, перенос одного эмбриона в полость матки проведен на 5-е сутки культивирования, беременность не наступила ни в одной программе ВРТ.

Учитывая наличие трех неэффективных программ ВРТ, у пациентки старшего репродуктивного возраста после подписания информированного добровольного согласия было решено провести лечение бесплодия методом ВРТ с использованием аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и новой технологии переноса САТ по протоколу с антГнРГ. У пациентки по данным ультразвукового исследования органов малого таза и гормонального обследования был сохраненный овариальный резерв (антимюллеров гормон – 1,15 нг/мл, ФСГ – 6,9 нг/мл, количество антральных фолликулов в обоих яичниках – 8–9). Стимуляция функции яичников проводилась с 4-го дня менструального цикла с помощью препарата человеческого менопаузального гормона и р-ФСГ в суммарной дозе 1650 МЕ. За 36 ч до ТВП назначен хорионический гонадотропин в дозе 8000 ЕД для финального созревания ооцитов.

На 13-й день менструального цикла проведена ТВП, аспирировано 4 ооцита. Эмбриологический этап проводили на одноступенчатых культуральных средах CSCM (США). Подготовка клеток кумулюса к сокультивированию проходила согласно методике, описанной в литературе [19], с модификациями, разработанными в ФГБУ «НМИЦ АГП им. академик В.И. Кулакова» Минздрава России. После проведения оплодотворения методом ИКСИ ооциты были перенесены в культуральную среду CSCM. Спустя 14–16 ч в условиях эмбриологической лаборатории производилась оценка оплодотворения, которое считалось случившимся при появлении двух пронуклеусов и двух полярных телец. После 24 ч культивирования в среде клетки кумулюса превратились в фибробластоподобные клетки. Все этапы культивирования проводили в мультигазовых инкубаторах СООК (Австралия) в индивидуальных каплях по 25 мкл. В каждую каплю были добавлены клетки кумулюса, расчет их количества не проводился. Кумулюсные клетки занимали не более 1/4 капли. На 5-е сутки культивирования 2 эмбриона достигли стадии бластоцисты и соответствовали качеству 3АА и 3ВВ согласно классификации Gardner и соавт. Эмбрион отличного качества (3АА) был перенесен на 5-е сутки после оплодотворения с использованием новой технологии переноса CAT с небольшим количеством разреженных клеток кумулюса. Эмбрион среднего качества (3ВВ) был криоконсервирован на 5-е сутки культивирования. Поддержка посттрансферного периода осуществлялась с помощью микронизированного прогестерона в дозе 300 мг в сутки.

В результате проведенной программы ВРТ в стимулированном цикле наступила беременность. На 14-й день после переноса эмбриона уровень β-субъединицы хорионического гонадотропина человека составил 978 мМЕ/мл. В I триместре беременности пациентка была госпитализирована на сроке 12–13 нед с угрозой прерывания беременности, проводилась спазмолитическая, гемостатическая и гормональная терапия. Во II триместре беременности на сроке 19–20 нед проведена хирургическая коррекция истмико-цервикальной недостаточности путем наложения двух циркулярных швов на шейку матки. III триместр беременности протекал без особенностей, на сроке 38–39 нед беременности пациентка была родоразрешена путем операции кесарева сечения в связи с оболочечным прикреплением пуповины в области нижнего края плаценты и ухудшением состояния плода по данным допплерометрии. Родилась живая доношенная девочка, с оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов, массой тела 3070 кг, ростом 51 см, кровопотеря в родах составила 700 мл. На момент написания публикации ребенок соматически здоров, развивается соответственно возрасту.

Заключение

Результаты многих исследований показали, что сокультивирование эмбриона с аутологичными клетками кумулюса повышает результативность программ ВРТ за счет положительного влияния кумулюсных клеток на процессы раннего эмбриогенеза и имплантацию эмбриона [9, 12, 14, 18, 19]. Данная методика исключает использование гетерогенных клеток, не подразумевает избыточные финансово-экономические затраты, а также не занимает у эмбриолога много времени.

Клетки кумулюса в процессе сокультивирования выделяют различные ростовые факторы (LIF, PAF-R, EGF и VEGF), а также гормоны (прогестерон) и цитокины. Кроме этого, клетки кумулюса стимулируют гликолиз, аминокислотный транспорт, биосинтез стеролов в развивающемся эмбрионе, а также имеют важное значение в цитоплазматическом созревании ооцита. Стоит подчеркнуть, что после оплодотворения зигота в течение первых 3 сут остается транскрипционно неактивной. Только на этапе материнско-зиготического перехода происходит активация зиготического генома с одновременной активацией и подавлением нескольких тысяч генов [20]. До активации зиготического генома поддержание необходимого уровня белков и транскриптов для оптимального метаболизма эмбриона осуществляется только благодаря генетическому аппарату ооцита. Показано, что сокультивирование оплодотворенного ооцита с аутологичными клетками кумулюса поддерживает его функционирование в раннем эмбриональном периоде за счет детоксикации среды культивирования и секреции эмбриотропных веществ [21, 22]. Описанный клинический случай, а также результаты исследований подтверждают актуальность использования аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса в программах ВРТ у пациенток с несколькими неудачными попытками в анамнезе. Данная методика не только позволяет повысить способность оплодотворенных ооцитов к дальнейшему развитию в условиях in vitro, но и может стать достойной альтернативой для оптимизации системы культивирования эмбрионов человека в программах ВРТ.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Работа выполнена в рамках финансирования государственного задания «Решение проблемы бесплодия в современных условиях путем разработки клинико-диагностической модели бесплодного брака и использования инновационных технологий в программах вспомогательной репродукции №121040600410-7».

Financing. The work was carried out with financing of the national research program “Solving the problem of infertility in modern conditions by developing a clinical and diagnostic model of infertility marriage and using innovative technologies in assisted reproduction programs №121040600410-7”.