Levonorgestrelsoderzhashchaya vnutrimatochnaya sistema "Mirena": kliniko-morfologicheskie aspekty

Full Text

Внутриматочная контрацепция (ВМК) имеет давнюю историю, на протяжение которой шел непрерывный процесс совершенствования внутриматочных спиралей, необходимый для повышения их эффективности, приемлемости, снижения числа побочных реакций и осложнений. К последнему поколению внутриматочных контрацептивов относятся гормонсодержащие внутриматочные системы (ВМС), из которых наибольший клинический интерес представляет левоноргестрелсодержащая внутриматочная рилизинг-система (ЛНГ-ВМС) "Мирена", сочетающая в себе свойства гормональной и внутриматочной контрацепции. Мирена представляет собой Т-образное пластиковое внутриматочное средство, в вертикальном стержне которого находится контейнер с 52 мг левоноргестрела, из которого ежедневно в полость матки выделяется до 20 мкг гормона. Левоноргестрел - синтетический гестаген из группы 19-норстероидов, прочно и избирательно связывается с рецепторами прогестерона и является в 100% биологически активным. Левоноргестрел является самым активным из известных гестагенов, обладает сильным антиэстрогенным и антигонадотропным эффектами и слабыми андрогенными свойствами. Механизм контрацептивного действия гормонсодержащих ВМС объясняют морфологическими и биохимическими изменениями в эндометрии, препятствующими имплантации оплодотворенной яйцеклетки в полости матки, изменениями физико-химических свойств цервикальной слизи, а также нарушениями процессов овуляции и синтеза гонадотропинов. Согласно результатам многочисленных многоцентровых исследований индекс Перля в процессе контрацепции миреной равен 0,1-0,2. Учитывая столь высокую контрацептивную эффективность ЛНГ-ВМС, некоторые исследователи приравнивают ее к хирургической стерилизации. К примеру, итоги крупного эпидемиологического исследования, проведенного в Финляндии, включившего 17 360 женщин, применявших мирену на протяжении 5 лет, подтвердили высокую контрацептивную эффективность рилизинг-системы с индексом Перля 0,18. Многоцентровые рандомизированные исследования являются наиболее надежными и показательными в оценке эффективности и приемлемости различных контрацептивных средств. Так, по результатам рандомизированного сравнительного исследования, проведенного K.Anderson и включившего 1821 женщину с ЛНГ-ВМС "Мирена" и 937 женщин с медьсодержащей ВМС "Nova-T", индекс Перля за 5 лет составил 0,09 и 1,26 соответственно. В аналогичном исследовании, проведенном I.Sivin и охватившем 2244 женщины с ЛНГ-ВМС и TCu 380Ag индекс Перля за 2 года контрацепции составил 0,2 и 0,9 соответственно. Параллельно со снижением сократительной активности маточных труб и ингибирующим влиянием на секрецию гонадотропинов осуществляется контрацептивный эффект гестагенов. Важно отметить, что гестагены блокируют овуляцию, если используются в высоких дозах. С целью выяснения вопроса о том, отмечается ли торможение процессов овуляции при применении мирены или нет, было проведено большое количество исследований. Большинство исследователей едины во мнении, что в процессе контрацепции овуляторная функция яичников не подавляется. По мнению M.Coleman, на протяжение первого года до 78,5% менструальных циклов бывают овуляторными, и лишь в небольшом проценте случаев отмечается торможение процессов овуляции с последующим развитием неполноценной лютеиновой фазы (НЛФ). Рис. 1. Характер менструального цикла на фоне ЛНГ-ВМС "Мирена". Рис. 2. Динамика симптомов первичной дисменореи и предменструального синдрома на фоне ЛНГ-ВМС "Мирена". Для подавления овуляции концентрация левоноргестрела в периферической крови должна быть не менее 50 мкг/сут. В процессе контрацепции миреной суточная доза гормона в периферическом кровотоке составляет 20 мкг/сут. Согласно исследованиям T.Luukkainen в течение первого года контрацепции миреной имеют место несколько вариантов реакции яичников: 1) ановуляция со снижением продукции эстрадиола, 2) ановуляция с повышением продукции эстрадиола, 3) овуляторный цикл с НЛФ, 4) двухфазный овуляторный цикл. По мнению большинства исследователей, основной механизм действия ЛНГ-ВМС "Мирена" реализуется на уровне эндометрия, в котором создается высокая концентрация левоноргестрела. Эндометрий является многокомпонентной системой, клеточные элементы которой находятся в сложной взаимосвязи. Структурно-функциональной единицей эндометрия является маточная железа с окружающей ее стромой и прилегающими кровеносными сосудами, жизнедеятельность которой обеспечивается межклеточными взаимодействиями в условиях влияния стероидных гормонов и паракринных факторов. Эндометрий состоит из 2 слоев: базального - более глубокого, прилегающего непосредственно к миометрию, и поверхностного функционального. В базальном слое локализуются стволовые клетки, обеспечивающие регенерацию эпителиальных структур функционального слоя после нарушений его целостности вследствие менструального кровотечения, после абортов, родов или выскабливаний. Базальный слой эндометрия малочувствителен к циклическим воздействиям половых гормонов, тогда как функциональный слой эндометрия обладает высокой чувствительностью к половым стероидным гормонам, прежде всего к 17b-эстрадиолу (Е2) и прогестерону, под воздействием которых в течение яичникового цикла эндометрий претерпевает ряд циклических изменений. Эстрогены одновременно с пролиферацией клеток эпителия стимулируют в течение фазы пролиферации развитие секреторного аппарата клеток и синтез рецепторов к эстрогенам и прогестерону, подготавливая эндометрий к полноценной секреторной трансформации. Медленное высвобождение левоноргестрела из резервуара приводит к истончению слизистой оболочки матки, атрофии эндометриальных желез и как следствие - к снижению функциональной активности эндометрия. Всеми авторами подчеркивается характерный морфологический признак - децидуализация клеток стромы эндометрия на фоне атрофии железистого компонента. По мнению E.Rutanen, децидуаподобные клетки являются видоизмененными клетками стромы и представляют собой крупные полигональные и специфические клетки с обильной цитоплазмой, четким ядром с выступающим ядрышком и особенной секреторной функцией. Они морфологически схожи с клетками эндометрия в предменструальном периоде и на ранних сроках беременности. Некоторые исследователи полагают, что на фоне мирены в эндометрии возможно развитие реакции на инородное тело, характерной для медьсодержащих ВМС. В этом случае на протяжение первых месяцев, а по мнению F.Strurrige, и в течение первого года контрацепции на фоне атрофии и децидуализации наблюдается повышение количества лейкоцитов, макрофагов, плазматических и тучных клеток, а также наличие некрозов в строме. Снижение функциональной активности и децидуаподобная трансформация стромы эндометрия развиваются уже через 1-3 мес после введения мирены и наблюдаются на протяжении всего периода контрацепции. Большинство авторов утверждают, что характерным изменениям подвергаются не только поверхностные слои эндометрия и места прилегания к ВМС, но и вся слизистая оболочка матки. Известно, что на фоне медьсодержащих ВМС возможно увеличение объема и продолжительности менструальной кровопотери, что у некоторых женщин приводит к развитию анемии. Так, по данным M.Coleman, частота отказов от использования медьсодержащих ВМС по причине кровотечений и болей составляет 3,6 на 100 женщин-лет для Т Си 380 Ag и Multiload Сu 375 и 7,3 на 100 женщин-лет для Nova T. В настоящее время доказано, что на фоне ЛНГ-ВМС наблюдается достоверное уменьшение уровня кровопотери во время менструации по сравнению с таковой до введения ВМС или на фоне медьсодержащих ВМС. Так, по данным K. Anderson, достоверное снижение кровопотери на фоне ЛНГ-ВМС через 3 мес контрацепции отмечено у 86% женщин, а через 12 мес - у 97% обследуемых. Исследование, проведенное в Латинской Америке, показало, что к концу первого года контрацепции коэффициент удалений ЛНГ-ВМС по причине кровотечений составил 0,8 на 100 женщин-лет и 7,3 - для медьсодержащих ВМС. При увеличении срока использования ВМС частота удалений медьсодержащих ВМС по причине менометроррагий превышала таковую для мирены до 10 раз. Уменьшение уровня кровопотери препятствует снижению уровня гемоглобина крови, а в некоторых случаях способствует повышению его концентрации. Так, по данным T. Luukkainen, к концу первого года применения ЛНГ-ВМС и медьсодержащей ВМС изменения исходного уровня гемоглобина составили +1,8 г/л и -1,3 г/л соответственно. Механизм снижения менструальной кровопотери на фоне мирены многофакторный и обусловлен рядом причин: атрофией эндометрия, уменьшением его васкуляризации, снижением уровня простагландинов и ингибированием фибринолитической активности. В настоящее время рядом исследований доказано, что локальное действие левоноргестрела приводит к изменению сосудистой системы эндометрия: уменьшается количество спиральных артерий, стенка их утолщается и подвергается фиброзным изменениям, отмечается тромбоз капилляров. Результатом локального действия левоноргестрела является полное прекращение циклических изменений в эндометрии, характеризующееся отсутствием менструаций у 20-25% женщин через 12 мес контрацепции, а по данным некоторых исследователей - у 50% женщин. Важно отметить, что большинство авторов считают неприемлемым использование термина "аменорея" для оценки отсутствия менструаций на фоне ЛНГ-ВМС, так как в данном случае аменорея не является заболеванием ввиду отсутствия нарушения функции яичников или гипоталамо-гипофизарной системы и является полностью обратимой. Возникновение межменструальных кровянистых выделений по типу "мазни" является обычным при использовании чистых гестагенов и отражает переходное состояние эндометрия от активного к атрофическому. По мнению I.Cameron, определенную роль в этом играет повышение проницаемости и ломкости сосудов эндометрия и изменения в спиральных артериях. P.Zhu и соавт. предполагают, что одной из причин нерегулярных кровянистых выделений на фоне "Мирены" может быть снижение активности VIII фактора свертывания крови в эндометрии по сравнению с исходным. Специфическое действие мирены на структуру эндометрия и кровеносные сосуды определяет возможность ее применения при меноррагиях, что в некоторых случаях может явиться альтернативой гистерэктомии. По данным рандомизированного исследования, проведенного в 5 клиниках Финляндии, из 236 женщин, обратившихся в клинику с жалобами на обильные менструации, 117 была произведена гистерэктомия, а 119 с лечебной целью введена ЛНГ-ВМС. В течение последующих 12 мес мирена оказалась неэффективной у 24 (20%) женщин, что потребовало в дальнейшем оперативного лечения, а у 81 (68%) пациентки отмечен положительный терапевтический эффект. K.Andersson и соавт. вводили мирену женщинам, имеющим исходный объем менструальной кровопотери более 80 мл. Через 1 год после введения спирали средний обьем кровопотери снизился со 176 до 15 мл. Исследования последних лет доказали, что антиэстрогенный и антимитотический эффекты мирены реализуются через непосредственное влияние высоких доз левоноргестрела на концентрацию эстрогеновых (ЭР) и прогестероновых (ПР) рецепторов в эндометрии, которые содержатся в эпителиальных и стромальных клетках эндометрия. Известно, что прогестерон действует как антагонист эстрогенов, подавляя образование эстрогеновых рецепторов и увеличивая активность 17b-дегидрогеназы и сульфотрансферазы. Эти оба фермента участвуют в превращении эстрадиола в слабоактивные метаболиты - эстрон и эстрона сульфат. По мнению Z.Gu, ингибирование синтеза ЭР на фоне длительного местного выделения прогестина делает эндометрий нечувствительным к действию эндогенно и экзогенно вводимых эстрогенов. При изучении морфологической структуры эндометрия и концентрации ЭР и ПР в нем перед введением и через 12 мес контрацепции H.Critley и соавт. обнаружили достоверное снижение их числа на фоне атрофии эндометрия с признаками децидуаподобной трансформации. Аналогичные результаты получены в работах S. Lu, который определял концентрацию ЭР и ПР у здоровых женщин, использующих мирену с целью контрацепции. По мнению автора, уменьшение количества рецепторов может играть ведущую роль в атрофии эндометрия и отсутствии в нем циклических изменений. Однако данный вопрос требует дальнейшего изучения, так как последние исследования показали, что через 6-12 мес после введения мирены возможно постепенное восстановление выработки рецепторов к половым стероидам. В настоящее время полагают, что реализация гормональных сигналов в клетках эндометрия осуществляется при участии факторов роста, продуцируемых клетками стромы эндометрия. Факторы роста (ФР) представляют собой группу пептидов и полипептидов, которые, взаимодействуя со специфическими рецепторами, расположенными на мембране клетки, инициируют включение внутриклеточных сигнальных путей и приводят к делению клеток. ФР могут оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее влияние на деление и дифференцировку клеток. Выраженным митогенным влиянием на клетки эндометрия обладают семейство эпидермального ФР и система инсулиноподобного фактора роста (ИПФР), представленная ИПФР-I и ИПФР-II, группой связывающих их белков (ИПФР-СБ) и специфическими рецепторами к ним. Предполагают, что локальная продукция ФР гормончувствительными тканями посредством активации процессов клеточной пролиферации способствует ростостимулирующему воздействию эстрогенов в них. Полагают, что циклическая стимуляция эндометрия эстрогенами осуществляется при участии ИПФР-I, который является своеобразным медиатором митогенного эффекта эстрогенов. По данным F.Crozl [85], эстрогены оказывают стимулирующее влияние на экспрессию м-РНК ИПФР-I и его рецепторы, а прогестерон ингибирует этот эффект. Биологическая активность ИПФР регулируется на клеточном уровне белками, способными обратимо связываться с ними - так называемыми ИПФР-СБ, секреция которых в эндометрии в свою очередь контролируется прогестероном. Таким образом, на примере системы ИПФР - ИПФР-СБ можно представить, что активность ФР усиливается под действием эстрогенов и ослабляется под влиянием прогестерона. На основании этого предположили: если эстрогены осуществляют свое действие через ИПФР-I, то ослабление его активности под действием прогестерона, стимулирующего синтез ИПФР-СБ, может явиться одним из механизмов антагонизма эстрогенов и прогестерона на молекулярном уровне. Учитывая это, было высказано мнение о том, что снижение функциональной активности эндометрия с последующим развитием атрофии на фоне ЛНГ-ВМС является следствием локального воздействия левоноргестрела на систему ИПФР - ИПФР-СБ. Данное предположение нашло свое отражение в работах E.Rutanen, изучавшей продукцию м-РНК ИПФР и ИПФР-СБ в эндометрии на фоне ЛНГ-ВМС. Автор доказала, что на фоне мирены в эндометрии стимулируется синтез белка, связывающего ИПФР-I, который, находясь в связанном состоянии, не может оказать стимулирующего эффекта на эндометрий. В другой работе автор изучала соотношение ИПФР-I и ИПФР-II в эндометрии на фоне мирены и доказала повышение экспрессии ИПФР-II, который участвует в дифференциальном ответе эндометрия на прогестаген и блокирует ИПФР-I, который, как известно, является медиатором эстрогенов в клетках эндометрия. В экспериментах E.Rutanen и соавт. также продемонстрировали, что на фоне локального выделения левоноргестрела в эндометрии повышается выработка белков, связывающих ИПФР-I, что в свою очередь подавляет митогенную активность эндометрия. Аналогичные результаты были получены M.Coleman и T.Luukainen, и авторы едины во мнении, что изменение в системе ИПФР и ИПФР-СБ является ведущим в развитии атрофии эндометрия с децидуаподобной трансформацией на фоне ЛНГ-ВМС "Мирена". В последнее время в литературе появились данные о локальном влиянии левоноргестрела не только на пролиферацию эндометрия, но и на процессы апоптоза. Апоптоз - запрограммированная гибель клеток, по сути своей является противоположностью митозу и представляет собой нормальный физиологический процесс, заключающийся в элиминации ненужных или избыточно пролиферирующих клеток, и играет важную роль в регуляции клеточного гомеостаза. Существуют активаторы и блокаторы апоптоза. К активаторам (индукторам) апоптоза относят ген Fas/APO-I и супрессорный ген опухоли Р-53, к ингибиторам - проонкогены Bcl-2 и Bcl-x, которые относятся к факторам выживания клетки и защищают ее от апоптоза. В настоящее время доказана важная роль апоптоза в функционировании репродуктивной системы женщины. Запрограммированная гибель клеток является важным звеном в процессах фолликулогенеза и атрезии фолликулов, регресии желтого тела и функционировании эндометрия. С целью изучения влияния ЛНГ-ВМС на процессы пролиферации и апоптоза в эндометрии T.Varuo и соавт. [188] определяли активность маркеров апоптоза Bcl-2 и гена Fas/APO-I. Результаты исследования продемонстрировали увеличение активности факторов запрограммированной гибели клеток на фоне снижения пролиферативных процессов в эндометрии уже через 3 мес контрацепции. Ускорение процессов апоптоза характеризовалось увеличением активности гена Fas/APO-I и уменьшением экспрессии протеина Bcl-2, что, по мнению авторов, является одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе подавления митотической активности эндометрия на фоне мирены. Одним из актуальных вопросов является изучение шейки матки на фоне внутриматочных контрацептивов, так как результаты раннее проведенных исследований немногочисленны и противоречивы. Левоноргестрел оказывает специфическое действие не только на уровне эндометрия, но и на уровне шейки матки - уменьшается количество цервикальной слизи, повышается ее вязкость, уменьшается объем крипт. Эти изменения препятствуют проникновению сперматозоидов и некоторых микроорганизмов в полость матки и маточные трубы, что способствует повышению контрацептивной эффективности ЛНГ-ВМС и снижает риск развития воспалительных заболеваний органов малого таза. Согласно результатам рандомизированных, многоцентровых исследований, проведенных среди женщин, использующих медь- и левоноргестрелсодержащие ВМС в течение 5-6 лет, не было выявлено различий в цитологических мазках из шейки матки. Результаты исследования, проведенного I.Sivin, среди женщин, использующих мирену на протяжение 5 лет, также свидетельствовали об отсутствии признаков атипии в цитологических мазках в процессе контрацепции. В то же время, по мнению B.Runnenbaum, синтетические прогестины могут вызывать атипический аденоматоз и микрожелезистую гиперплазию слизистой цервикального канала. J.Misra и соавт. изучали мазки из шейки матки у 686 пациенток с подкожными имплантами левоноргестрела ("Норплант") и с ЛНГ-ВМС "Мирена". По их данным, за период контрацепции было диагностировано 18 мазков с легкой и 1 со средней степенью дисплазии. В процессе контрацепции ни у одной пациентки не наблюдали перехода в тяжелую дисплазию, наоборот, во всех наблюдениях произошел регресс. В то же время случаи дисплазий наблюдали на фоне мирены в 2 раза чаще, чем на фоне норпланта - 4,9 и 2,1% соответственно. Данный факт исследователи объясняют локальным действием самой ВМС и ее нитей в цервикальном канале. Большинство исследователей отмечают значительно низкий уровень воспалительных осложнений на фоне ЛНГ-ВМС по сравнению с медьсодержащими ВМС. Полагают, что основными факторами, способствующими уменьшению риска воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ) в процессе контрацепции ЛНГ-ВМС, является повышение вязкости цервикальной слизи и уменьшение ее количества, также этому способствуют атрофия эндометрия и уменьшение длительности и интенсивности менструальных кровотечений. В то же время все исследователи подчеркивают, что ЛНГ-ВМС не защищает от инфекций, передаваемых половым путем, и соответственно не снижает их частоту в процессе контрацепции. По результатам многоцентрового рандомизированного сравнительного исследования, включившего 1821 пациентку с ЛНГ-ВМС и 937 с медьсодержащей ВМС (Nova-T), было установленно следующее: в течение 1-го года контрацепции частота воспалительных осложнений была одинакова в обеих группах, к концу 3-го года этот показатель составил 0,5 в группе с ЛНГ-ВМС и 2,0 в группе с Nova-T. Согласно результатам исследования, проведенного G.Rubo, общий уровень ВЗОМТ за 5-летний период на фоне ЛНГ-ВМС составил 0,8 и 2,2 в группе с Nova-T, частота эндометритов также была выше в группе пациенток с медьсодержащей ВМС и составила 4,0 и 1,5 соответственно. По данным M.Coleman, показатель воспалительных осложнений в течение всего периода контрацепции ЛНГ-ВМС составляет 0,18-1,6 на 1000 женщин/лет, а по данным Annon - 1 на 1000 женщин/лет, что соответствует общепопуляционным показателям. В научно-поликлиническом отделении НЦАГиП РАМН было проведено исследование по изучению клинико-морфологических особенностей контрацепции с применением ЛНГ-ВМС "Мирена" у женщин репродуктивного возраста. В исследование были включены 39 женщин, в возрасте от 24 до 48 лет (средний возраст составил 36,3±3 года). Критериями исключения служили противопоказания к применению гормонсодержащих ВМС: беременность или подозрение на нее, злокачественные новообразования органов репродуктивной системы, кровянистые выделения из половых путей неясной этиологии, острые или хронические ВЗОМТ в настоящем или за последние 3 мес, деформации полости матки, острый гепатит, тромбофлебит или тромбоэмболии в анамнезе. В результате исследования подтверждена высокая контрацептивная эффективность ЛНГ-ВМС "Мирена" - случаев наступления беременности в процессе исследования зарегистрировано не было, также не было отмечено экспульсий или воспалительных осложнений контрацепции. В процессе наблюдения установлено, что основной побочной реакцией на фоне ЛНГ-ВМС "Мирена" являлись скудные межменструальные кровянистые выделения, наибольшая частота которых была зарегистрирована у 76,9% женщин на протяжении первых 6 мес контрацепции. В дальнейшем частота и продолжительность ациклических кровянистых выделений уменьшались, и к концу первого года контрацепции они наблюдались у 53,8% женщин. В процессе контрацепции отмечено достоверное снижение продолжительности менструального кровотечения с 5,3±0,4 дней до 1,8±0,7 дней к 12-му месяцу контрацепции (р<0,01), а к концу первого года контрацепции - у 30,8% женщин, т.е. почти у каждой 3-й пациентки развилась аменорея (рис. 1). Несмотря на наличие межменструальных кровянистых выделений, менструальноподобная реакция на фоне мирены была скудной, и в динамике контрацепции наблюдали достоверное повышение средних значений гемоглобина со 124,2±3,0 г/л до 133,3±2,0 г/л (р<0,05) на протяжении 12 мес наблюдения. Динамическое ультразвуковое исследование позволило установить достоверное уменьшение толщины М-эхо по сравнению с исходным - с 0,57±0,05 см до 0,35±0,05 см через 12 мес контрацепции (р<0,001), что свидетельствует о временном прекращении циклических процессов в эндометрии и его истончении. Одной из задач исследования явилось изучение особенностей морфофункционального состояния эндометрия. По результатам гистологического исследования эндометрия, уже через 6 мес контрацепции в слизистой оболочке тела матки наблюдали мелкоочаговую децидуаподобную реакцию и отек стромы. С течением времени децидуаподобная реакция становилась более выраженной, маточные железы были выстланы эпителием без признаков функциональной активности, отмечены признаки расстройства кровообращения. На протяжение первого года контрацепции кольпоскопические картины не претерпели существенных изменений, а цитологические мазки соответствовали I классу по классификации Папаниколау. Характерной особенностью цитологических мазков, взятых на фоне ЛНГ-ВМС "Мирена", явилось наличие клеточных элементов с вакуолизацией ядер и цитоплазмы, а также единичных клеток плоского эпителия с явлениями цитолиза на фоне большого количества слизи. Следует отметить положительный терапевтический эффект мирены у пациенток с предменструальным синдромом (ПМС) и первичной дисменореей (рис. 2). До начала исследования симптомы ПМС различной степени тяжести были диагностированны у 28,2% женщин преимущественно позднего репродуктивного возраста. На протяжение первых 6-8 мес контрацепции уменьшение выраженности симптомов ПМС наблюдали у каждой второй пациентки, а к концу первого года контрацепции - только у 10,3% женщин (р<0,05). Аналогичная закономерность отмечена у пациенток с первичной дисменореей. Через 12 мес контрацепции болезненные менструации сохранялись лишь у 2,6%, тогда как до введения мирены на них жаловались 30,8% пациенток (р<0,05). Таким образом, результаты проведенного исследования подтвердили данные о высокой контрацептивной эффективности и приемлемости ЛНГ-ВМС "Мирена". Снижение менструальной кровопотери и развитие аменореи, обусловленные локальным действием левоноргестрела и сопровождающиеся снижением функциональной активности эндометрия, позволяют применять мирену не только с контрацептивной целью, но и при некоторых гинекологических заболеваниях, обусловленных гиперполименореей, и гиперпластических процессах эндометрия.

About the authors

V N Prilepskaya

F S Revazova

References

Supplementary files