Pervye v Rossii uspeshnye rezul'taty provedeniya preimplantatsionnoy geneticheskoy diagnostiki monogennykh zabolevaniy

Abstract

В данной статье приведены результаты преимплантационной генетической диагностики (ПГД) эмбрионов пациентов из группы риска наследственных моногенных заболеваний, на основании которых в полость матки были перенесены только эмбрионы – носители или свободные от мутаций гена муковисцидоза. В результате работы родились первые в России дети после проведения ПГД моногенных заболеваний.

Full Text

Резюме В данной статье приведены результаты преимплантационной генетической диагностики (ПГД) эмбрионов пациентов из группы риска наследственных моногенных заболеваний, на основании которых в полость матки были перенесены только эмбрионы – носители или свободные от мутаций гена муковисцидоза. В результате работы родились первые в России дети после проведения ПГД моногенных заболеваний. Ключевые слова: преимплантационная генетическая диагностика, моногенные заболевания, экстракорпоральное оплодотворение, ИКСИ. Введение В настоящее время метод экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), вошедший в клиническую практику в конце 70-х годов ХХ в. благодаря революционным трудам Э.Стептоу и Р.Эдвардса, является одним из основных методов лечения бесплодия, широко применяющимся во всем мире [1]. Долгое время единственным показанием для проведения ЭКО оставалось бесплодие, но постепенно стала формироваться новая группа пациентов, обращающихся к ЭКО, – это фертильные пары, в которых один или оба супруга являются носителями хромосомных нарушений или мутаций генов, вызывающих моногенные заболевания. Для таких пар был разработан новый метод диагностики – преимплантационная генетическая диагностика (ПГД), т.е. диагностика хромосомных анеуплоидий или моногенных заболеваний, проводимая с помощью цитогенетических методов (FISH) или молекулярно-биологических методов – полимеразной цепной реакции (ПЦР) – на единичных бластомерах, полученных в результате биопсии эмбрионов, находящихся на ранней стадии развития. В настоящее время наиболее распространенной методикой выявления наследственных заболеваний является пренатальная диагностика, суть которой приведена на рис. 1. Необходимо учитывать, что пренатальная диагностика, выполняемая при уже наступившей беременности, является инвазивной методикой, при проведении которой возможно развитие определенных осложнений, включая и прерывание беременности. Получение положительного результата при проведении диагностики ставит родителей в крайне трудное положение – необходимости принятия решения о прерывании беременности, что не только тяжело с моральной точки зрения, но и может иметь значительное число возможных осложнений, в частности бесплодие. Кроме того, у значительного числа пациентов по медицинским показаниям прерывается не одна, а несколько беременностей подряд. В начале 90-х годов прошлого столетия появились первые сообщения о беременностях, наступивших после проведения ПГД некоторых моногенных заболеваний (независимые группы под руководством А.Хэндисайда и Ю.Верлинского) [2]. С тех пор число ПГД, проведенных на различные наследственные заболевания, неуклонно растет. Под эгидой Европейского сообщества репродукции человека и эмбриологии был организован ПГД-консорциум, который на сегодняшний день объединяет 67 стран. Цель создания данной организации – обмен информацией и опытом работы между лабораториями мира, которые занимаются разработкой методических подходов для определения мутаций на единичных половых клетках. По данным VII консорциума (2004 г.) было проведено порядка 600 лечебных циклов с использованием ПГД моногенных заболеваний [3]. Данная методика позволяет отбирать и переносить в полость матки только эмбрионы, не несущие мутаций, и, таким образом, блокировать наследование многих заболеваний, не заставляя семейную пару прерывать уже наступившую беременность при обнаружении заболевания. Благодаря внедрению ПГД в клиническую практику удалось принципиально изменить подход к предупреждению наследственных заболеваний в семьях из группы риска (рис. 2). Одним из первых заболеваний, для которых использована ПГД, был муковисцидоз. Данная патология и сейчас остается наиболее распространенным показанием для выполнения ПГД. В России первым заболеванием, для которого выполнена преиплантационная диагностика, также был муковисцидоз. Результаты выполнения ПГД этого и других моногенных заболеваний представлены в данной статье. Материалы и методы После подтверждения генотипов родителей, апробации дизайнов праймеров для каждой мутации на геномной ДНК и моделях единичных клеток (единичные сперматозоиды, единичные лимфоциты клеток крови) проводили программу ЭКО – ИКСИ – ПГД, состоящую из следующих этапов: 1. Стимуляция контролируемой суперовуляции с целью обеспечения одномоментного созревания нескольких ооцитов в яичниках. 2. Трансвагинальная пункция фолликулов для получения ооцитов проводится под внутривенной анестезией при достижении принятых признаков «созревания» фолликулов. Получение сперматозоидов супруга. 3. Оплодотворение зрелых ооцитов сперматозоидами супруга с оценкой оплодотворения через 16–18 ч. 4. Биопсия бластомеров на 3-й день после трансвагинальной пункции фолликулов при достижении эмбрионами 6–8-клеточной стадии. Проводилась биопсия одного бластомера каждого эмбриона хорошего качества. 5. ПГД методом ПЦР: ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Eppendorf» (Германия) с использованием Taq-полимеразы производства «Синтол» (Россия). Использовали праймеры к определенным CF-мутациям и полиморфным маркерам (производство «Синтол») и программы для двухраундной ПЦР, рекомендованные Ю.Верлинским [3]. В дальнейшем анализировали полученные продукты амплификации. Если мутация произошла в результате нуклеотидной замены, ее тестировали с помощью рестриктного анализа (например, в случае мутации G542X использовали рестриктазу MvaI, а для мутации N1303K – DdeI). Если продукты амплификации получались большого размера (~>400 п.н.), их анализировали на агарозных гелях. Анализ основной части продуктов ПЦР осуществляли на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRIZM 3110 по протоколам фирмы «Applied Biosystems» (США), с использованием предоставленного фирмой программного обеспечения (GeneScan, v3.2.1.). 6. Перенос в полость матки протестированных эмбрионов («здоровых») – без или носителей МВ-мутаций эуплоидных эмбрионов на стадии бластоцисты. 7. В качестве маркера наступившей беременности использовали определение уровня b-субъединицы хорионического гормона человека (ХГЧ) в сыворотке крови через 14 сут после переноса эмбрионов. 8. Выполнение подтверждающей пренатальной диагностики (биопсии ворсин хориона) в соответствии с принятыми рекомендациями. Результаты В настоящее время в клинике прошли лечение пациенты со следующими заболеваниями. Муковисцидоз В Клинике пролечены 8 семейных пар, у 7 из них в анамнезе – гибель ребенка от муковисцидоза, только в 1 случае жив ребенок 14 лет, больной смешанной формой муковисцидоза. Средний возраст пациенток составил 35±1,9 года. Обнаружено носительство следующих мутаций у родителей: Del 21 kb, N1303K, F508, G542X, 5T/7T, 5T/9T. В результате проведенного ЭКО–ИКСИ получено 106 эмбрионов, из которых пригодными к биопсии были признаны 79. Молекулярно-генетическое исследование биоптата бластомеров показало, что у 54 (69%) эмбрионов нет мутаций или есть гетерозиготное носительство мутаций. У 31 (39%) эмбриона в ходе данного исследования обнаружена хромосомная патология. В среднем пациенткам переносили по 2,4 эмбриона. В результате проведенного лечения наступило 4 беременности. Первая беременность закончилась родоразрешением путем кесарева сечения на сроке 38 нед, в результате чего родились первые в России дети после успешного проведения ПГД моногенных заболеваний. Вторая беременность завершилась своевременными родами через естественные родовые пути в ноябре 2007 г., третья прогрессирует, в настоящее время ее срок составляет 24 нед, срок последней беременности – 9 нед. Спинальная миоатрофия Верднига–Гоффманна В Клинику «Мать и дитя» обратились 5 семейных пар, в каждой из которых оба родителя – носители мутаций, приводящих к развитию спинальной миоатрофии – делеция экзонов 7 и 8 гена SMN. Средний возраст пациенток составил 36±4,2 года. Проведение программы ЭКО–ИКСИ привело к получению 52 эмбрионов, из которых пригодным к биопсии был признан 41. В результате проведенного молекулярно-генетического исследования биоптата бластомеров было выяснено, что у 28 (69%) эмбрионов нет мутаций или есть носительство мутаций. Помимо того, у 16 (39%) эмбрионов в ходе данного исследования обнаружена хромосомная патология. В среднем пациенткам переносили по 2,1 эмбриона. В результате проведенного лечения наступило 2 беременности. Первая беременность закончилась родоразрешением путем кесарева сечения на сроке 38 нед в ноябре 2007 г., вторая беременность прогрессирует, в настоящее время ее срок составляет 27 нед. Галактоземия У семейной пары (мать – носитель мутации Q188R, отец – носитель мутации K285N), обратившейся в Клинику, есть сын 14 лет, носитель K285N. В анамнезе – гибель ребенка в возрасте 2 мес (гомозиготное состояние по мутациям K285N/Q188R). После моделирования данного случая ПГД на единичных ядросодержащих клетках крови родителей была проведена первая попытка ЭКО–ИКСИ по классическому длинному протоколу, оказавшаяся неудачной. В ходе второй попытки было получено 11 эмбрионов, для проведения биопсии на стадии дробления признано пригодными 9 эмбрионов, на момент переноса аэмбрионов пригодными к переносу были следующие эмбрионы: 1 эмбрион-носитель (В3ВВ) и 2 – здоровые (В2АВ, В2АА). В результате проведенного лечения наступила одноплодная беременность, выполненная контрольная биопсия ворсин хориона подтвердила отсутствие мутаций у плода. Адреногенитальный синдром (АГС, или врожденная дисфункция коры надпочечников – ВДКН) – сольтеряющая форма (синдром Дебре–Фибигера) В Клинику «Мать и дитя» обратилась семейная пара, в анамнезе – смерть ребенка в 6 мес от ВДКН сольтеряющей формы. В соответствии с медико-генетическим заключением оба родителя информативны по мутациям, приводящим к ВДКН (мать – мутация сайта сплайсинга во 2-м интроне, отец – делеция гена CYP21OHB в 3-м экзоне). При проведении трансвагинальной пункции фолликулов в ходе программы ЭКО получено 23 ооцита, при оценке качества эмбрионов на стадии 6–8 бластомеров пригодными к биопсии признано 12 эмбрионов. В результате выполненной ПГД обнаружено крайне высокое содержание эмбрионов (11), гомозиготных по данным мутациям, только 1 эмбрион был разрешен к переносу, учитывая его гетерозиготное состояние по определяемым мутациям и аутосомно-рецессивный характер наследования данного заболевания. На момент переноса данного эмбриона в полость матки его качество было расценено как В5АА. На 11-е сутки после переноса эмбриона уровень ХГЧ в сыворотке крови составил 396 мМЕ/мл, при ультразвуковом исследовании через 20 дней обнаружено 1 плодное яйцо, визуализирован эмбрион, детектировано сердцебиение. В настоящее время срок беременности составляет 6–7 нед, семейная пара ожидает проведения пренатальной диагностики. Наследственная моторно-сенсорная нейропатия (НМСН, CMT, болезнь Шарко–Мари–Туса) тип I, II В Клинику обратилась семейная пара, в которой супруга не имеет мутаций, приводящих к данному заболеванию, а у мужа на фоне типичных клинических проявлений имеется дупликация на хромосоме 17p11.2 – p12 (локус ШМТ1А), тип наследования – аутосомно-доминантный. Беременностей у жены не было. Учитывая высокую вероятность передачи по наследству данного заболевания, семейная пара обратилась для проведения ПГД болезни Шарко–Мари–Туса, не дожидаясь наступления спонтанной беременности. В ходе выполнения программы ЭКО при проведении трансвагинальной пункции фолликулов аспирировано 18 ооцитов, получено 13 эмбрионов, пригодных к биопсии. После проведения ПГД было выяснено, что из 13 протестированных эмбрионов у 7 обнаружена мутация, т.е. данные эмбрионы непригодны к переносу в полость матки, учитывая аутосомно-доминантный тип наследования. Из остальных 6 эмбрионов на момент переноса в полость матки 4 эмбриона соответствовали эмбриологическим требованиям (В3ВВ, В3АВ, В4АА, В5ВВ): 2 из них были использованы для переноса, 2 оставшихся были криоконсервированы. Беременность не наступила, в настоящее время проводится подготовка к криопротоколу. Всем пациенткам (кроме одной пары, отказавшейся от инвазивной диагностики) при наступлении беременности проводили подтверждающую ПГД – биопсию ворсин хориона и в 2 случаях – амниоцентез. Во всех случаях было получено подтверждение правильности выполненной ПГД. Таким образом, в ходе проведенной работы всего было выполнено 18 программ ЭКО-ПГД (от 1 до 3 попыток у каждой пациентки). Всего было получено 219 эмбрионов, из которых пригодными для проведения биопсии были признаны 145 (66,2%). В результате выполненного скрининга хромосомной патологии у 63 (43,5%) эмбрионов обнаружены анеуплоидии или нарушения детерминации пола. Пригодными к переносу в полость матки эмбрионами, т.е. теми, которые не приведут к фенотипическим проявлениям заболевания (свободные от мутаций или гетерозиготы при аутосомно-рецессивном типе наследования), были признаны только 36 – по 2,4 эмбриона на попытку. Обсуждение Основная причина, заставляющая родителей, входящих в группу риска по тому или иному наследственному заболеванию, отказаться от рождения собственных детей или даже прибегнуть к использованию донорских гамет или усыновлению чужих детей, является страх рождения больного ребенка. Рождение больного ребенка, помимо выраженного перманентного стресса для родителей, часто обусловливает и значительные финансовые нагрузки, вызванные необходимостью длительного лечения, проведения специфических мероприятий по социальной адаптации больного ребенка. В последние годы достигнут значительный прогресс в области молекулярно-биологических технологий, который дал возможность работать с гаплоидными и диплоидными геномами единичных соматических и половых клеток человека. Эти достижения сразу нашли свое практическое применение в медицине, в том числе в области репродуктивных технологий. На сегодняшний день, по данным ПГД-консорциума, определение генетического здоровья эмбрионов проводится для более чем 100 наследственных моногенных заболеваний [4]. Несмотря на то что в России существуют клиники, проводящие ПГД хромосомных анеуплоидий методом FISH, или КФ-ПЦР, успешное выполнение ПГД моногенных заболеваний является принципиально новой возможностью предупреждения рождения больных детей в группах риска по этим заболеваниям. Это связано с разными причинами – не только экономическими или социальными, но и техническими, методическими. Так, хорошо известны сложности проведения ПГД моногенных заболеваний. Во-первых, это работа с единичным диплоидным геномом бластомера. Во-вторых, при работе с единичными клетками возможно как выпадение аллеля (ADO – allele dropout), частота которого достаточно высока для бластомеров, так и преимущественная амплификация одного аллеля, что требует введения дополнительных полиморфных маркеров. В основном это или микросателлитные последовательности (STSs), или единичные нуклеотидные замены, которые либо окружают ген, либо присутствуют внутри гена в непосредственной близости от исследуемой мутации. Итак, в России родились первые здоровые дети после ПГД моногенно-наследуемых болезней. Список моногенных заболеваний в центре «Мать и дитя» постоянно расширяется. На сегодняшний день он включает такие заболевания, как спинальная амиотрофия Верднига–Гоффманна, хорея Гентингтона, галактоземия, адреналовая гипоплазия (СУР), синдром Марфана, адреногенитальный синдром, гемофилия В, преимплантационное определение резус-фактора эмбриона при резус-сенсибилизации матери с резус-конфликтом при беременности в анамнезе. Более того, после проведения ПГД по многим из этих заболеваний уже родились здоровые дети. Таким образом, данная работа показывает высокую эффективность проводимой ПГД моногенно-наследуемых заболеваний, в частности муковисцидоза. ПГД приводит к наступлению беременности физически здоровым плодом (свободным от мутаций или носителем в случае аутосомно-рецессивного типа наследования), освобождает женщину от необходимости прерывания беременности на большом сроке при обнаружении заболевания у плода. Практические рекомендации акушерам-гинекологам ПГД следует рекомендовать супружеским парам, входящим в группу риска передачи наследственных заболеваний, в случаях, когда: 1. Один или оба супруга больны или являются носителями мутаций, приводящих к данным заболеваниям. 2. В семье рождались дети с моногенными заболеваниями или были выполнены аборты по медицинским показаниям при обнаружении наследственного заболевания у плода при выполнении пренатальной диагностики. 3. Семейная пара старшего репродуктивного возраста с высокой вероятностью хромосомных нарушений у потомства. 4. У супруги имеется привычное невынашивание беременности на ранних сроках при отсутствии видимых причин. 5. Обнаружена высокая спонтанная частота анеуплоидий при исследовании материала абортуса при спонтанных прерываниях беременности. 6. Обнаружены транслокации у супругов при обследовании перед выполнением ЭКО или подготовке к беременности. 7. У супружеской пары в анамнезе имеется большое число неудачных попыток ЭКО при отсутствии видимых причин.