In vitro fertilization and preimplantation genetic testing methods in infertility treatment of a woman with karyotype 46,XX,ins(13;4)(q34;p14p15.3),inv(4)(p14q12). Case report

Full Text

Введение

В настоящее время исследователями разных стран показано, что у пациентов с различными нарушениями репродуктивной функции (НРФ) изменения в хромосомном наборе встречаются в разы чаще, чем в популяции. Цитогенетическое исследование лимфоцитов крови (исследование кариотипа) является «золотым стандартом» генетического обследования супружеских пар с НРФ. В общей популяции изменения в кариотипе встречаются с частотой 1,77±0,06% [1]. Частота структурных перестроек в хромосомах у пациентов с НРФ наблюдается в 2,37% случаев [2]. В настоящее время известно о 800 вариантах хромосомных аномалий, связанных с изменением числа хромосом или их структуры. Одними из редких хромосомных патологий являются инсерция (вставка хромосомного участка) и инверсия (поворот участка хромосомы) [3].

Как правило, сбалансированные хромосомные перестройки не влияют на здоровье их носителей. Однако у людей с измененным кариотипом в процессе деления клетки могут формироваться гаметы с несбалансированными вариантами хромосомных перестроек. Эмбрионы, полученные в результате оплодотворения таких половых клеток, будут иметь патологию в хромосомном наборе, которая может приводить к остановке развития беременности, самопроизвольному ее прерыванию, а также являться причиной рождения генетически больного ребенка. Именно поэтому хромосомные изменения в кариотипе пациентов, проходящих лечение в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), могут приводить к снижению эффективности этих программ.

С целью профилактики рождения больного ребенка и невынашивания беременности в рамках программ ВРТ необходимо применять преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии в эмбрионах (ПГТ-А). А у пациентов с нарушениями в кариотипе целесообразным является исследование хромосом, вовлеченных в перестройку, т.е. преимплантационное генетическое тестирование структурных перестроек (ПГТ-СП).

До настоящего времени наиболее распространенными методами ПГТ-СП являлись флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (КФ-ПЦР), сравнительная геномная гибридизация (arr-CGH). Однако данные методики имеют ряд принципиальных ограничений и не всегда отражают полную картину молекулярного кариотипа. Последние годы широкое распространение приобрел современный метод высокопроизводительного секвенирования (NGS), который все больше вытесняет другие методы преимплантационного генетического тестирования в зарубежных и российских клиниках ВРТ. NGS более точно обнаруживает и анеуплоидии, и делеции/дупликации. Принцип данного метода построен на распознании последовательности нуклеиновых кислот, что существенно отличает его от других тактик.

В настоящей работе описан клинический случай программы лечения бесплодия методами ВРТ у пациентки с аномальным кариотипом 46,XX,ins(13;4)(q34;p14p15.3),inv(4)(p14q12), сочетающим инсерцию и инверсию. Также в работе определены структура и частота хромосомных аберраций в преимплантационных эмбрионах нескольких программ стимуляции овуляции методом NGS.

Описание клинического случая

В 2020 г. пациентка З. 37 лет обратилась с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 5 лет регулярной половой жизни без контрацепции. Из анамнеза: менструации с 17 лет, цикл регулярный по 5 дней через 26 дней без особенностей. В 2015 г. проведена лапароскопия с резекцией правого яичника по поводу эндометриоидной кисты. У женщины выявлены бронхоэктатическая болезнь и желудочковая экстрасистолия, гипотиреоз. При цитогенетическом анализе кариотипа пациентки выявили изменения в виде инсерции и инверсии одновременно: 46,XX,ins(13;4)(q34;p14p15.3),inv(4)(p14q12). Наследственность не отягощена. Кариотип родителей женщины и родного брата в норме. Муж пациентки 44 лет, соматически здоров, детей нет, показатели спермограммы: объем 3 мл, концентрация сперматозоидов 30 млн/мл, подвижных сперматозоидов 82%, морфологически нормальных форм 4%. Брак у обоих супругов первый, не родственный. Пациенты изъявили желание на проведение программы ВРТ с ПГТ-СП методом NGS.

Женщине провели 3 цикла стимуляции по стандартному протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона с применением препаратов Гонал-Ф, Оргалутран, Диферелин. После осуществления оплодотворения методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) ооциты перенесены в культуральную среду CSCM (Irvine Sc., США) с целью дальнейшего культивирования. Оценку наступления стадии двух пронуклеусов (формирования зиготы) проводили через 14–16 ч после оплодотворения. Все этапы культивирования осуществляли в мультигазовых инкубаторах СООК (Ирландия) в каплях по 25 мкл под маслом (Irvine Sc., США). Среду CSCM (Irvine Sc., США) не меняли в течение 4 сут культивирования. На 5-е сутки после оплодотворения провели процедуру биопсии трофэктодермы для выполнения ПГТ-А и ПГТ-СП по показаниям. В 1-м цикле ВРТ получили 3 эмбриона, пригодных для ПГТ-СП, во 2 и 3-м – 7 и 6 соответственно. Всего для анализа после секвенирования доступно 16 эмбрионов. Они подверглись криоконсервации методом витрификации на средах Kitazato, хранение в условиях жидкого азота.

Перед секвенированием осуществлялась полногеномная амплификация ДНК-клеток трофэктодермы. С помощью электрофореза проводился анализ качества полученного продукта WGA. ПГТ-СП осуществлялся методом NGS на приборе MiSeq компании Illumina с применением коммерческого набора VeriSeq PGS Kit. Данные, полученные прибором, обрабатывались с помощью программного обеспечения BlueFuse Multi.

По результатам ПГТ-А и ПГТ-СП, выполненных по методике NGS, с нормальным молекулярным кариотипом было 2 эмбриона: по одному в 1-м цикле ВРТ и 3-м цикле стимуляции. Фото профилей секвенирования в программе BlueFuse Multi представлены на рис. 1. В результате переноса здорового эмбриона в 1-м цикле стимуляции беременность не наступила. Здоровый эмбрион, полученный в 3-м цикле стимуляции, до настоящего времени хранится в условиях жидкого азота.

 

Рис. 1. Пример результатов анализов секвенирования клеток трофэктодермы методом NGS на платформе Illumina в программе BlueFuse Multi у пациентки с кариотипом 46,XX,ins(13;4)(q34;p14p15.3),inv(4)(p14q12): а – Seq(1-22)x2,(XY)x1, нормальный молекулярный кариотип; b – Seq(4p15.31-4p14)x3,(XY)x1, выявлен дополнительный генетический материал участка 4p15.31-4p14 хромосомы 4; c – Seq(4p15.32 -> 4p14)x1,(10q23.31 -> 10q26.3)x1,(15)x1,(XY)x1, выявлена недостача генетического материала участка 4p15.31-4p14 хромосомы 4, участка 10q23.31 -> 10q26.3 хромосомы 10 и моносомия хромосомы 15. / Fig. 1. An example of the test results of the trophectoderm cells sequencing in a patient with a karyotype 46, XX, ins (13;4) (q34;p14p15.3), inv(4)(p14q12) by NGS on the Illumina platform using BlueFuse Multi software: a – Seq(1-22)x2,(XY)x1, normal molecular karyotype; b – Seq(4p15.31-4p14)x3,(XY)x1, additional genetic material of the 4p15.31-4p14 region of chromosome 4; c – Seq(4p15.32 -> 4p14)x1, (10q23.31 -> 10q26.3)x1,(15)x1,(XY)x1, a lack of genetic material of the 4p15.31-4p14 region of chromosome 4, the 10q23region.31 -> 10q26.3 chromosome 10 and monosomy of chromosome 15.

 

Спектр хромосомной патологии во всех преимплантационных эмбрионах, выявленный при NGS, представлен в табл. 1.

 

Таблица 1. Структура хромосомной патологии, выявленной при секвенировании образцов клеток трофэктодермы / Table 1. The structure of chromosomal pathology detected by sequencing of trophectoderm cell samples

Не сбалансированные эмбрионы по известной перестройке	Не сбалансированные эмбрионы по известной перестройке с мозаицизмом	Эмбрионы, не сбалансированные по известной перестройке и с патологией других хромосом	Эмбрионы с анеуплоидией хромосом, не вовлеченных в хромосомную перестройку	Мозаицизм хромосом
6	2	1	3	2

 

Результат анализа секвенирования показал, что несбалансированные варианты по известной патологии составили 9 (56,3%) наблюдений из 16, при этом в 6 (37%) только по известной в кариотипе патологии и в 3 (19%) представлены одновременно с патологией других хромосом или с мозаицизмом. Эмбрионы с анеуплоидией хромосом, не вовлеченных в хромосомную перестройку, показаны в 3 (21%) наблюдениях из всей выявленной патологии (14 случаев).

При переносе эмбриона с нормальным молекулярным кариотипом, полученным в первой попытке ВРТ, беременность не наступила. В настоящее время пациентка готовится к переносу второго эмбриона с нормальным молекулярным кариотипом.

Обсуждение

Одними из наиболее сложных пациентов, нуждающихся в лечении бесплодия методами ВРТ, являются пары, где у одного из супругов имеются хромосомные аберрации. Из особенностей анамнеза данной группы пациентов можно отметить длительный период бесплодия, множественные неудачные попытки ВРТ, самопроизвольное прерывание беременности, а также рождение ребенка с врожденной хромосомной патологией. Дискутабельным среди специалистов разных стран остается вопрос о целесообразности применения программ ВРТ у пациентов с нарушениями в кариотипе и не имеющих бесплодия в анамнезе. По утверждению одних исследователей, у этих пар возможны наступление самопроизвольной беременности и рождение здорового ребенка без применения программ ВРТ, однако другие выступают против потенциального риска и заявляют о рациональности сокращения времени наступления беременности здоровым плодом. Для более глубокого понимания процесса мейоза у пациентов со структурными перестройками в хромосомном наборе необходимо проводить изучение кариотипа их эмбрионов. Результаты кариотипирования эмбрионов могут позволить разработать более точные методы преимплантационного тестирования и точнее рассчитать риски возникновения хромосомной патологии у ребенка. Данное исследование доказало, что применение NGS-секвенирования на платформе компании Illumina станет хорошим подготовительным этапом в ПГТ-СП. Эта платформа позволяет анализировать около 1 млн прочтений (ридов) в одном образце, что является принципиальным отличием от других компаний (в сравнении с 150–200 тыс. прочтений у других компаний). Увеличенное количество прочтений качественно влияет на точность выявления генетических нарушений. При направлении пациентов на ПГТ-СП необходимо не только придавать значение методу секвенирования, но и обращать внимание на платформу, на основе которой проводятся тестирования. По исследованиям других авторов, метод NGS у пациентов с измененным кариотипом значительно точнее выявляет хромосомные изменения у эмбрионов. Согласно ретроспективному тестированию продукта WGA после aCGH методом NGS выявлены изменения участков хромосом de novo и пониженный уровень мозаицизма, где aCGH находился в пределах нормативных значений [5]. И итоги авторов статьи, и данные других специалистов подтвердили, что метод NGS четко выявляет в эмбрионах мозаицизм, а также делеции, дупликации и анеуплоидии. B. Brunet и соавт. придерживаются этих результатов [6].

Заключение

На основании полученных данных можно подтвердить, что ПГТ-СП методом NGS является одним из самых точных методов по определению хромосомных аберраций у преимплантационных эмбрионов и должен быть рекомендован у пар с измененным кариотипом в рамках программы ВРТ с целью профилактики невынашивания беременности, рождения больного ребенка.

Представленные в настоящей статье исследования показывают, что находки с хромосомными изменениями кариотипа возможны у преимплатационных эмбрионов пациентов в виде генетических изменений других хромосом (в частности, мозаицизма) помимо патологии, вовлеченных в перестройку хромосом, что подтверждается результатами других исследователей [4]. Наличие разнообразной группы хромосомных аномалий указывает на необходимость исследовать эмбрионы у этой группы пациентов на все хромосомы. Современной альтернативой на уровне с пренатальной диагностикой может явиться ПГТ-СП методом NGS у супружеских пар, которые имеют фактор риска рождения ребенка с врожденной или наследственной патологией, либо у категории пациентов, которые выступают против медицинского аборта по религиозным, моральным или другим мотивам.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.

About the authors

Zhanna I. Glinkina

Hi-Tech Genetics Ltd.

Author for correspondence.
Email: janna435@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0312-3797

D. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Elena V. Kulakova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: e_kulakova@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0002-4433-4163

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Elena G. Lebedeva

Clinical hospital MD GROUP

Email: elena.g.lebedeva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8010-412X

obstetrician-gynecologist

Russian Federation, Moscow

Varvara S. Kuzmicheva

Moscow Regional Research Institute of Obstetrics and Gynecology

Email: barbarakuzmicheva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3797-6360

Graduate Student

Russian Federation, Moscow

Nataliya P. Makarova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: np_makarova@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0003-1396-7272

D. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files