Kompleksnoe geneticheskoe obsledovanie muzhchin: programmy IKSI

Full Text

Введение В последние годы лечение мужского бесплодия характеризуется значительным прогрессом, связанным главным образом с внедрением в широкую медицинскую практику метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Этот передовой подход позволяет иметь потомство мужчинам с тяжелыми формами олиго-, астено-, терато- и даже азооспермии, ранее обреченных на абсолютное бесплодие. При включении пациентов в программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не стоит забывать, что возникновение патологических состояний репродуктивной системы часто обусловлено хромосомными, генными мутациями и наличием наследственной предрасположенности к заболеванию. Генетические мутации родителей, приводящие к нарушению репродукции и невозможности зачатия ребенка естественным путем, при применении программ ВРТ могут передаваться будущему потомству. До сих пор в литературе имеются противоречивые данные о генетических нарушениях у детей, рожденных в программах ВРТ. Многие авторы утверждают, что частота пороков развития у детей, рожденных после этих программ, достоверно не отличается от общепопуляционной. В то же время другие авторы отмечают повышение уровня пороков развития в среднем в 2,5 раза у мальчиков, рожденных в программе ИКСИ, по сравнению с девочками [1, 2]. Некоторые исследователи считают, что в программе ИКСИ возникают хромосомные мутации de novo и встречаются значительно чаще, чем в популяции [1]. Таким образом, пациенты с тяжелыми формами бесплодия, нуждающиеся в лечении методами ВРТ, требуют к себе повышенной генетической настороженности, так как главная задача ВРТ - получение здорового потомства. Материал и методы В отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ГУ НЦ АГ и П РАМН были обследованы 274 мужчины, которые имели отклонения в показателях спермограммы и нуждались в проведении процедуры ИКСИ. Первичное бесплодие среди пациентов отмечено в 48% случаев. Средний возраст мужчин составлял 38,5 года (от 24 до 63 лет). Медико-генетическое консультирование включало: клинико- генеалогический метод; цитогенетический (кариотипирование лимфоцитов периферической крови); молекулярно-цитогенетический (FISH-метод); молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция - ПЦР); серологический метод исследования антигенов системы HLA I класса. Исследование эякулята проводили всем пациентам не реже 2 раз с интервалом в 2 нед по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1999). Исследование ДНК крови на наличие микроделеций AZF локусов хромосомы Y проведено ПЦР-методом 59 мужчинам с необструктивной азооспермией (17 человек) и олигозооспермией (42 человека) с концентрацией сперматозоидов в 1 мл менее 5 млн. Возраст пациентов был от 25 до 45 лет. В работе использовали мультиплексную амплификацию с набором из 12 праймеров, позволяющих исследовать следующие Y-специфические маркеры: SRY, ZFY, sY84, sY86, sY615, sY127, sY134, sY254, sY255, sY242, sY157, sY 1192. Исследования антигенов системы HLA I класса проведены у мужчин русской популяции: 211 пациентов с отклонениями показателей в спермограмме; 106 с нормозооспермией (группа контроля). Для молекулярно-цитогенетических исследований препараты клеток эякулята готовили по методу Guttenbach (1997 г.). Для флюоресцентной гибридизации in situ использовали зонды фирмы "Vysis". ДНК-пробы предназначены для идентификации a-сателлитной последовательности центромерного региона Х хромосомы (Хр11.1-q11.1) и сателлита III Y хромосомы (Yq12). Гибридизацию in situ проводили в соответствии с протоколом, рекомендуемым фирмой-производителем. Количество проанализированных ядер сперматозоидов зависело от количества сперматозоидов в эякуляте. У пациентов с выраженной олигозооспермией были проанализированы все доступные для анализа сперматозоиды, у мужчин с нормозооспермией - не меньше 1000 сперматозоидов. Таблица 1. Врожденные пороки развития, моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов, выявленные у мужчин программы ИКСИ Наименование врожденных пороков развития и генетических нарушений Число наблюдений Врожденная дисфункция коры надпочечников, обусловленная недостаточностью 21-гидроксилазы (мягкая форма) 3 Гетерозиготное носительство мутации гена CYP21B 3 Носительство доминантного мутантного гена, приводящего к врожденным порокам развития почек у детей 1 Синдром Дэль-Кастильо 1 Спинно-бульбарная амиотрофия Кеннеди 1 Синдром Поланда 1 Гипохондроплазия 1 Брахидактилия 1 Различные врожденные пороки почек 5 Синдактилия 1 Врожденный порок сердца 1 Цели генетического обследования пациентов • постановка диагноза; • выявление возможной генетической причины заболевания; • определение типа наследования заболевания; • получение информации относительно течения, вариабельности и экспрессивности заболевания. Таблица 2. Результаты цитогенетического исследования мужчин программы ИКСИ Кариотип Число наблюдений (n=274) 46,XY 251 47,XYY 1 47,XXY 4 47,XXY/46,XY 1 47,XYY/46,XY 1 46,ХХ 1 46,Х,del(Y)(q11q23) 1 46,ХY, inv (7)(p11q11) 2 46,XY, inv (3)(p21q12) 1 46,XY,der(13/14)(q10q10) 5 46,XY,t(7/16)(q21q22) 1 46,XY,t(8/15)(q13qter) 1 46,XY,t(15/18)(qterq11) 1 46,XY,t(8/20)(qterq11) 1 46,XY,t(12/22)(q22qter) 1 46,XY/46,XYdel 16(q12.1qter) 1 Таблица 3. Молекулярно-цитогенетическое исследование сперматозоидов мужчин из супружеских пар, включенных в программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ Группа Кариотип Уровень анеуплоидии гоносом в сперматозоидах, % 1 (35 мужчин с нормозооспермией) 46, ХY (группа сравнения) (33 наблюдения) 0,22 47,ХYY (1 наблюдение) 2,6 46, ХY, inv (2)(p12q14) (1 наблюдение) 0,7 2 (20 мужчин с показателями спермограммы на границе нормы) 46, ХY (19 наблюдений) 0,5 46,ХY.ishХр11.1-q11.1(DXZ1x1), ish.Yq12(DYZ1x1)[470]/ 46,ХХ.ishХр11.1-q11.1(DXZ1x2)[30] (1 наблюдение) 3,7 3 (32 мужчины с олиго-, астенозооспермией) 46, ХY (31 наблюдение) 0,48 47,XYY.ishХр11.1-q11.1(DXZ1x1), ish.Yq12(DYZ1x2)[400]/ 46,XY.ishХр11.1-q11.1(DXZ1x1), ish.Yq12(DYZ1x1) [100] (1 наблюдение) 0,8 4 (26 мужчин с тератозооспермией) 46, ХY (25 наблюдений) 0,62 46, ХY, inv (7) (p11q11) (1 наблюдение) 1,2 5 (44 мужчины с ОАТ) 46, ХY (40 наблюдений) 0,85 46,ХY,inv (3)(p21q12) (1 наблюдение) 1,4 46,ХY,inv(7)(p11q11) (1 наблюдение) 1,0 46, ХY, t(13/14)(q10q10) (3 наблюдения) 1,7 46, ХY, t(8/15)(q13qter) (1 наблюдение) 1,4 Результаты При медико-генетическом консультировании у 19 (7%) из 274 мужчин выявлены врожденные пороки развития, моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов (табл. 1). У 6 из 19 пациентов была выявлена врожденная дисфункция коры надпочечников, обусловленная недостаточностью 21- гидроксилазы (мягкая форма), и гетерозиготное носительство мутации гена CYP21B. В тех случаях, когда у одного из супругов была выявлена мутация данного гена, второму супругу проводилось аналогичное исследование для исключения носительства по исследуемому гену (учитывая высокую частоту данной мутации гена в популяции 1:30). Только в одном случае оба супруга являлись гетерозиготными носителями мутации гена CYP21B. Исследование кариотипа в культивированных лимфоцитах крови 274 мужчин обнаружило у 23 (8%) мужчин изменения хромосомного набора (табл. 2). В 14 из 23 наблюдений были обнаружены перестройки аутосом, которые в основном были представлены транслокациями и перицентрическими инверсиями. В половине наблюдений транслокации аутосом были представлены робертсоновскими транслокациями хромосом 13 и 14. Из 3 выявленных перицентрических инверсий 2 были представлены инверсиями хромосомы 7. Исследование кариотипа 2 мужчин показало у них делеции хромосомы Y и хромосомы 16 (мозаичная форма). Кроме того, были выявлены кариотипы, соответствующие синдрому Клайнфельтера (полная и мозаичная форма), синдрому полисомии хромосомы Y (полная и мозаичная форма), а у 1 мужчины кариотип был представлен - 46,ХХ. Для уточнения кариотипа с целью определения доли аномального клона клеток при подозрении на мозаицизм половых хромосом у пациентов дополнительно проведено молекулярно-цитогенетическое исследование лимфоцитов. Выявление уровня соотношения клонов с нормальным и измененным кариотипом имеет принципиальное значение при выборе метода лечения пациентов с бесплодием и прогнозе здоровья потомства. Исследование крови на наличие микроделеций локусов хромосомы Y: SRY, ZFY, sY84, sY86, sY615, sY127, sY134, sY254, sY255, sY242, sY157, sY 1192, проведено у 59 мужчин с азооспермией и олигозооспермией (концентрацией сперматозоидов в 1 мл эякулята менее 5 млн). Наличие микроделеций хромосомы Y выявлено у 5 (8,4%) пациентов. Все микроделеции были выявлены у мужчин с олигозооспермией тяжелой степени. Ни у одного из мужчин с азооспермией не наблюдались мутации генов AZF локусов хромосомы Y. Исследование частоты нерасхождения хромосом Х и Y в сперматозоидах с помощью FISH-метода проведено 157 пациентам (55 мужчин - программа ЭКО и 102 мужчины - программа ИКСИ). Возраст пациентов был от 24 до 63 лет. У 11 пациентов определены хромосомные аберрации в кариотипе, которые были представлены: в 3 наблюдениях нарушениями в комплексе половых хромосом; в 4 - хромосомными транслокациями; в 4 наблюдениях перицентрическими инверсиями хромосом. Всем пациентам проведено молекулярно-цитогенетическое исследование сперматозоидов с использованием зондов на хромосомы Х и Y. Все обследуемые пациенты были подразделены на 5 групп: 1-я группа - мужчины, с нормальными показателями спермограммы; 2-я - мужчины, показатели спермограммы которых находились на границе нормы (концентрация сперматозоидов в 1 мл - 20 млн, активно подвижных сперматозоидов - 25%, нормальная морфология сперматозоидов - 30%); 3-я - мужчины, у которых в спермограмме наблюдали олигозооспермию, астенозооспермию или сочетанную форму патозооспермии - олигоастенозооспермию; 4-я - мужчины, в спермограмме которых, наблюдали тератозооспермию; 5-я - мужчины, в спермограмме которых определена сочетанная форма патозооспермии - олигоастенотератозооспермия (ОАТ). Результаты FISH-исследования сперматозоидов мужчин программы ЭКО, ИКСИ представлены в табл. 3 (результаты кариотипов приведены с учетом FISH-метода и без учета хромосомных вариантов). Мужчины 1-й группы с нормальными показателями спермограммы и нормальным кариотипом составили группу сравнения. Уровень анеуплоидии гоносом в сперматозоидах у них составил 0,22%. Самая высокая частота анеуплоидии гоносом в сперматозоидах была выявлена у пациентов с нарушениями в комплексе половых хромосом в кариотипе (3,7; 2,6%). Наши исследования показали, что хромосомные аберрации одних хромосом (в частности, инверсии и транслокации) в кариотипах пациентов влияют на расхождение других хромосом в процессе мейоза (хромосом Х и Y), что подтверждает теорию существования интерхромосомного эффекта. Полученные данные свидетельствуют о существовании корреляции между хромосомными изменениями в лимфоцитах периферической крови и половых клетках в независимости от типа хромосомных аберраций в кариотипе. Наши исследования выявили достоверную корреляцию между частотой анеуплоидии гоносом в сперматозоидах и различными состояниями сперматогенеза у мужчин с нормальными кариотипами (при сравнении уровня анеуплоидии гоносом 2, 3, 4 и 5-й групп с группой сравнения p<0,05). У мужчин с нормальным кариотипом и сочетанной формой отклонений в показателях спермограммы по концентрации, подвижности, морфологии ОАТ был выявлен самый высокий уровень анеуплоидии в сперматозоидах по изучаемым хромосомам - 0,85%. У мужчин с показателями спермограммы на границе нормы - 0,50%; с олигоастенозооспермией - 0,48%; с тератозооспермией - 0,62%. Полученные данные указывают на то, что при любых отклонениях в показателях спермограммы наблюдается повышенный уровень анеуплоидии гоносом в сперматозоидах. Учитывая статистически достоверное отличие частоты анеуплоидии гоносом в сперматозоидах у мужчин с показателями спермограммы на границе нормы и нормальным кариотипом по сравнению с группой сравнения, мы считаем, что эти супружеские пары также следует относить к группе риска пациентов, у которых в потомстве могут возникать хромосомные аберрации. У пациентов во всех представленных группах с нормальными и измененными кариотипами соотношение сперматозоидов с хромосомой Х к сперматозоидам с хромосомой Y было 1:1. Это же соотношение сохранялось и у мужчин с полисомией хромосомы Y (кариотип 47, ХYY). Соотношение нерасхождения хромосом ХY: ХХ: YY у мужчин программы ЭКО (с нормозооспермией и показателями спермограммы на границе нормы) нормальными кариотипами составило 3,6:1,5:1, у мужчин программы ИКСИ и нормальными кариотипами - 2,7:1,7:1 (среднее значение). Высокий уровень нерасхождений хромосом ХY говорит о том, что нарушения процесса расхождения хромосом чаще происходят при первом делении мейоза. Только у пациентов с полисомией хромосомы Y соотношение частоты нерасхождения хромосом YY к нерасхождению ХХ было больше единицы (5:1:1,5). Кроме того, выявленный у них высокий уровень сперматозоидов с хромосомами ХY может подтверждать теорию о том, что у мужчин с кариотипами 47, ХYY в процессе мейоза может образовываться повышенная частота сперматозоидов с хромосомным набором 24, ХY и 24, YY. При теоретическом расчете анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин с кариотипами 47, ХYY уровень нерасхождений хромосом должен быть значительно выше, чем выявляется на практике. Это подтверждает теорию о существовании специальных механизмов, блокирующих развитие клеток с аберрантным кариотипом. Один из путей успешного решения проблем профилактики заболевания связан с выявлением предрасположенности индивидуума к ним. По данным ряда исследователей, антигены системы HLA могут быть успешно использованы для этой цели. Мы обследовали антигены системы HLA у 3 групп мужчин русской популяции: 1 - с нормозооспермией (106 человек), 2 - с олигозооспермией, астенозооспермией или сочетанной формой олигоастенозооспермией (102 человека), 3 - с тератозооспермией или в сочетании с олиго-, астенозооспермией (109 человек). Положительная ассоциация антигенов HLA I класса была выявлена только у пациентов с тератозооспермией (p<0,05). Риск возникновения заболевания более 4 был обнаружен при гаплотипах A10,B35 (4,5) и A26,B18 (4,7). Сочетание обоих антигенов в гаплотипе B18 и B35 увеличивает риск до 11. Обсуждение Разработка новых технологий в лечении бесплодия, выяснение причин бесплодия и получение здорового потомства при использовании ВРТ является актуальной задачей современной медицины. Своевременное определение причин нарушения репродуктивной функции, связанное с выявлением хромосомных и генных мутаций, приобретает особое значение в изучении репродуктивной системы и является одной из ведущих проблем медицинской генетики. Учитывая, что мужской фактор бесплодия составляет примерно 50% от общего процента бесплодия, было интересно выяснить причины, приводящие у мужчин к нарушению репродуктивной функции (НРФ). Особый интерес представляют пациенты с бесплодием неясного генеза, а также пациенты с ярко выраженными формами патоспермии (отклонения всех показателей в спермограмме: концентрации, подвижности, морфологии и др.). Выявленные врожденные пороки развития и генетические нарушения у пациентов с бесплодием указывает на необходимость медико-генетического консультирования пациентов, нуждающихся в лечении методами ВРТ и притом до включения их в программу ВРТ. Основную группу риска пациентов, у которых потомству могут быть переданы генетические мутации или возникнуть de novo, составляют супружеские пары с генетическими мутациями, а также женщины старше 35 лет. Другими словами, не вызывает сомнения необходимость разработки профилактических мероприятий через медико-генетическое консультирование у пациентов программы ВРТ, алгоритма генетического обследования, рекомендаций по оптимизации программы ЭКО. Наши данные о высоком уровне хромосомных аберраций, микроделеций хромосомы Y у пациентов с нарушением репродуктивной функции по сравнению с общепопуляционными совпадают с данными других авторов [3-8]. Изучение характера хромосомных аномалий имеет важное значение ввиду их высокой частоты при нарушении репродуктивной функции. Кроме того, выявление хромосомной патологии у пациентов с НРФ и нуждающихся в лечении методами ВРТ имеет принципиальное значение. Применение ВРТ у носителей мутаций без учета особенностей их генотипа может привести к многочисленным отрицательным результатам проведения программы ЭКО, повлиять на вынашивание беременности и в конечном итоге привести к рождению ребенка с врожденными и генетическими аномалиями. Полученные нами данные указывают на высокую частоту микроделеций хромосомы Y у пациентов с НРФ - 8,4%, что совпадает с результатами исследования других авторов [9-11]. Интересен тот факт, что все микроделеции были выявлены у мужчин с олигозооспермией и ни в одном из случаев у пациентов с азооспермией. А также, что все микроделеции представлены мутацией в локусе AZFc хромосомы Y. По всей видимости, это связано с небольшим числом обследуемых мужчин. Тем не менее тот факт, что все микроделеции были выявлены в локусе AZFc хромосомы Y, указывает на то, что эти мутации занимают превалирующее место среди микроделеций AZF локусов хромосомы Y, что также совпадает с мнением других авторов [7, 11]. Учитывая высокий уровень сперматозоидов с хромосомными аберрациями у пациентов программы ИКСИ, мы рекомендуем исследовать их половые клетки на уровень анеуплоидии перед проведением ВРТ для установления потенциального риска появления в их потомстве ребенка с генетической патологией. Использование в программе ИКСИ гамет с хромосомными изменениями может негативно влиять на эффективность программы и привести к рождению детей с хромосомными аберрациями. Таким образом, супружеским парам, у мужей которых в сперматозоидах имеется повышенная частота анеуплоидии, рекомендуется проведение преимплантационной или инвазивной пренатальной диагностики. Полученные нами данные о повышенной частоте хромосомных нарушений в половых клетках у мужчин с различными формами нарушений сперматогенеза совпадают с данными других исследователей. По данным M.Pang и соавт. (1999 г.), частота дисомии аутосом в сперматозоидах составила 5,4% у мужчин с ОАТ по сравнению с 0,05-0,2% в контроле; частота диплоидных сперматозоидов у пациентов с ОАТ была от 0,4 до 9,6%; контроль показал значение 0.04% (исследователи в своей работе использовали зонды к хромосомам 4, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 13, 17, 18, 21, Х и Y). Применяя зонды на хромосомы 18, 21, Х и Y, L.Colombero и соавт. (1999 г.) также выявили эту закономерность. Однако уровень анеуплоидии был несколько ниже, а показатели в контрольной группе значительно выше: 2,7% у мужчин с ОАТ против 1,8% в контроле. Повышенная доля хромосомных аберраций в сперматозоидах у мужчин с ОАТ отмечена также другими авторами [5, 8, 12]. Антигены системы HLA как генетические маркеры приобрели важное значение для выявления предрасположенности к возникновению ряда заболеваний, связанных с мужским бесплодием. Полученные нами данные об ассоциации антигенов системы HLA и отклонениями в спермограмме совпадают с данными других авторов. D.Aleksovski и соавт. (1988 г.) при исследовании мужчин югославов с азооспермией и олигозооспермией неизвестной этиологии выявил повышенную ассоциацию антигенов системы HLA с нарушением сперматогенеза. Наиболее частыми антигенами локуса А были: А26, А28; локус В был представлен только антигеном В18. В.В. Михайличенко и соавт. (1992 г.) исследовали у мужчин - жителей Санкт-Петербурга, ассоциации антигенов HLA системы с инфертильностью, обусловленной левосторонним варикоцеле. Обследование 97 инфертильных мужчин с различной степенью олигозооспермии (37 - с I степенью, 36 - со II степенью и 24 - с III степенью) выявило повышение частоты встречаемости антигенов по локусу А - А3; А11; АW19; а по локусу В - В13; В16; В22; В27; В35, а также снижение частоты В5. Наиболее выраженной генетической связью с инфертильностью при варикоцеле обладают антигены А3; В13; В22. Они также показали, что наиболее сильную гаметную ассоциацию у этих больных дают гаплотипы А3-В22; А11-В22; АW19-В22. Повышенная ассоциация антигенов системы HLA с идиопатической азооспермией была найдена также H.Miura и соавт. (1998 г.) у 65 японских мужчин. Частота антигенов HLA А33, В13 и В44 была значительно выше по сравнению с контрольной группой. Авторы предполагают, что антигены I класса системы HLA являются важными генетическими маркерами предрасположенности к возникновению идиопатической азооспермии. Таким образом, исследование антигенов системы HLA I класса у пациентов с нарушением сперматогенеза может иметь значение для прогноза здоровья их будущего потомства. Генетическое обследование пациентов с нарушением репродуктивной функции приобретает определенное значение ввиду выявления у них высокой частоты генетических мутаций. Следует отметить, что эти обследования необходимо проводить мужчинам до включения их в программу ИКСИ. Знания о частоте и характере генетических нарушений у пациентов с нарушением репродуктивной функции позволят улучшить лечебно-диагностическую и консультативно-диагностическую помощь супружеским парам с бесплодием, а также совершенствовать мероприятия, направленные на профилактику бесплодия [15]. Все сказанное указывает на необходимость разработки и широкого внедрения в медицинскую практику профилактических мероприятий, в частности преимплантационной генетической диагностики, которая проводится в рамках программы экстракорпорального оплодотворения и дает возможность генетической селекции эмбрионов у пациентов с генетическими нарушениями.

About the authors

Zh I Glinkina

References

Supplementary files