Kul'tural'nyy metod v otsenke chuvstvitel'nosti Trichomonas vaginalis k preparatam 5-nitroimidazol'nogo ryada i drugikh grupp

Full Text

Ежегодно в мире, по данным ВОЗ, регистрируют более 333 млн новых случаев заболеваний, передаваемых половым путем (ЗППП). Из них на мочеполовой трихомоноз приходится 170 млн случаев, что свидетельствует о его ведущей роли в этиологической структуре ЗППП [1–4]. Согласно результатам эпидемиологических исследований, в Российской Федерации на 100 тыс. населения ежегодно регистрируется от 261 до 343 случаев мочеполового трихомоноза, 101 – сифилиса, 82,3 – гонореи и 95 случаев хламидиоза [4, 5]. Мочеполовой трихомоноз имеет большое медицинское и социально-экономическое значение. У женщин наиболее часто диагностируются трихомонадные эндоцервициты (81%), вульвовагиниты (62%), реже – уретриты (18%), воспаления ампулы прямой кишки [4, 6, 7]. Изолированное поражение того или иного участка мочеполовой системы наблюдается крайне редко. Мочеполовой трихомоноз у женщин часто проявляется в форме паразитоносительства или протекает в хронической форме [4, 6, 7]. У женщин, инфицированных Т. vaginalis в период беременности, наблюдается предрасположенность к повреждениям плаценты [8], преждевременным родам и невынашиванию плода. Многие авторы отмечают, что трихомонадная инвазия может быть причиной развития опухолей шейки матки, различных воспалительных заболеваний малого таза и бесплодия [9]. Наряду с другими ЗППП, мочеполовой трихомоноз повышает риск инфицирования ВИЧ, так как в очаге воспаления наблюдается скопление ВИЧ-чувствительных Т-лимфоцитов [10, 11]. По данным ВОЗ (2003 г.), 11% всех случаев уретритов негонококковой этиологии у мужчин вызваны заражением T. vaginalis . Трихомонадный уретрит – наиболее частая форма мочеполового трихомоноза у мужчин. В 30% случаев он протекает в острой форме, в 60–70% – в хронической форме или бессимптомно [4]. У 30–50% больных диагностируются осложнения в виде простатитов, везикулитов, эпидидимитов, баланопоститов. Особую значимость приобретает проблема лекарственноустойчивых штаммов Т. vaginalis , их клинического и эпидемиологического значения [11–13]. В 1962 г. S.Squires и J.Fadzean для определения чувствительности T.vaginalis предложили метод серийных разведений метронидазола в жидкой питательной среде в анаэробных условиях. В качестве критерия оценки чувствительности они использовали минимальную подавляющую концентрацию (МПК), которая соответствует наименьшей концентрации препарата, которая вызывает иммобилизацию у 100% клеток трихомонад. С помощью данной методики авторам удалось доказать, что все изученные ими штаммы T. vaginalis , выделенные от больных трихомонозом, были чувствительны к метронидазолу в диапазоне концентраций препарата от 0,25 до 1 мкг/мл. В 90-х годах ХХ века появились работы, свидетельствующие о возникновении и распространении штаммов T. vaginalis , устойчивых к значительно более высоким концентрациям метронидазола: 32 [14], 50 и даже 250 мкг/мл [13]. Тогда же было обосновано положение о том, что чувствительными к действию метронидазола в анаэробных условиях штаммами T. vaginalis следует считать лишь те, для которых паразитоцидный эффект препарата наблюдается в концентрации выше чем 15 мкг/мл [13, 15]. Процент резистентных к метронидазолу штаммов T. vaginalis , выделенных в эти годы от больных трихомонозом, колебался от 5 [16] до 20% [12]. Тем не менее исследования по этой проблеме пока еще немногочисленны, а полученные результаты во многом противоречивы. Прогресс в решении данной проблемы пока не достигнут в связи с отсутствием доступных для широкой практики методов определения чувствительности T. vaginalis к антипротозойным препаратам. Цель настоящего исследования – оценка чувствительности штаммов Trichomonas vaginalis к антипротозойным препаратам при помощи культурального метода с использованием различных критериев и выбор препаратов для лечения больных мочеполовым трихомонозом, обладающих наибольшей эффективностью. Для реализации цели исследования необходимо было решить следующие задачи: а) обосновать диагностическую ценность культурального метода и возможности его использования для оценки чувствительности штаммов T.vaginalis к антипротозойным препаратам; б) произвести сравнительную оценку чувствительности штаммов T.vaginalis у больных мочеполовым трихомонозом к наиболее часто используемым антипротозойным препаратам. Диагностику мочеполового трихомоноза проводили путем микроскопии нативных препаратов, а также мазков, окрашенных метиленовым синим по Романовскому–Гимзе и модифицированному способу Грама. Для подтверждения диагноза трихомоноза и оценки чувствительности штаммов использовали культуральный метод. В тех случаях, когда паразитологическая диагностика была затруднена, а также для контроля реконвалесцентов использовали метод полимеразной цепной реакции. Для выявления трихомонад в нативных препаратах исследовали осадок мочи, секрет предстательной железы и эякулят у мужчин и смыв из влагалища у женщин. Нативные препараты готовили и исследовали сразу после взятия материала. Если это было невозможно, то его помещали в питательную среду, обеспечивающую кратковременное сохранение трихомонад, из расчета 1 мл исследуемого материала на 5 мл среды. Для приготовления препарата на предметное стекло наносили каплю теплого изотонического раствора натрия хлорида или раствора Зингера–Локка и смешивали с ним исследуемый материал. Взвесь накрывали покровным стеклом и микроскопировали при увеличении объектива 40 и окуляра 7 или 10. При изучении нативного препарата особое внимание обращали на размеры и форму трихомонад, характер их движения, внутреннее содержимое клеток. В типичных случаях трихомонады выявлялись в виде подвижных образований грушевидной, реже – овальной формы, размером в среднем от 13,3 до 16,6 мкм. Характер их движений был толчкообразным. Иногда наблюдалось движение свободных жгутиков. Ядра трихомонад часто не обнаруживались или были плохо различимы. Цитоплазма трихомонад была зернистой, часто вакуолизированной. В нативных мазках также обнаруживались лейкоциты, которые в отличие от трихомонад имели округлую, реже – овальную форму, их размеры, как правило, не превышали 10 мкм. Цитоплазма лейкоцитов была прозрачной, зернистость не отмечалась. Сегментоядерные нейтрофильные гранулоциты обычно содержали хорошо различимое ядро. Иногда обнаруживались амебоидные формы T. vaginalis , длина тела которых достигала 30 мкм, а также атипично делящиеся (почкующиеся) клетки. Основными дифференциально-диагностическими критериями, отличающими атипичные трихомонады от клеток эпителия и лейкоцитов, служили наличие в цитоплазме этих простейших выраженной зернистости и вакуолей, а также отсутствие хорошо различимого ядра. Kроме того, они были значительно крупнее, чем наиболее часто наблюдающиеся форменные элементы – сегментоядерные нейтрофильные гранулоциты. По размеру такие трихомонады могли быть сопоставимы с моноцитами, которые в отличие от них имели четко выраженное ядро и никогда не обнаруживались в значительных концентрациях (несколько клеток в каждом поле зрения). При отсутствии типичных форм клеток трихомонад диагноз трихомоноза был предположительным и подтверждался результатами других методов. Для диагностики мочеполового трихомоноза многие авторы рекомендуют культуральный метод с использованием питательных сред СKДС, СДС-199 [17–19], синтетической среды Линстеда [20]; среды Даймонда [21], среды "Vagicult" и др. В 1998 г. нами была модифицирована среда СДС-199 [22], которая имела следующий состав: 1) 100 мл солевого раствора (натрия хлорида 6,5 г, калия хлорида 0,14 г, кальция хлорида 0,12 г, натрия бикарбоната 0,2 г, 0,5 мл 0,2% раствора метиленового синего, дистиллированной воды до 1 л); 2) 20 мл среды 199; 3) 450 мг соляно-кислого цистеина; 4) 30 мл сыворотки крови эмбрионов телят (без консерванта); 5) 10 мл 20% раствора мальтозы; 6) тиамина хлорида 5% и пиридоксина гидрохлорида 5% по 0,25 мл и аскорбиновой кислоты 5% – 0,5 мл на 100 мл среды; 7) ампициллина натриевой соли 125 000 ЕД и гентамицина 40 000 ЕД на 100 мл среды. Солевой раствор автоклавировали при температуре 120 о С в течение 30 мин, остальные ингредиенты добавляли стерильно после охлаждения среды. Антибиотики и витамины добавляли в питательную среду непосредственно перед использованием. Среда была светло-зеленого цвета, прозрачная; показатель рН среды составлял 5,5–6,0. Питательную среду объемом 4,5 мл помещали в стерильные пробирки и заливали слоем стерильного вазелинового масла толщиной 5 мм для создания анаэробных условий культивирования трихомонад. Посев производили пастеровской пипеткой путем помещения 0,5–1,0 мл исследуемого материала на дно пробирок. Микроскопическое исследование производили через 48 и 96 ч после посева. При положительных результатах трихомонады давали придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой брался материал для микроскопического исследования. Чувствительность штаммов Т. vagi nalis к метронидазолу in vitro определяли с помощью метода серийных разведений препарата в питательной среде СДС-199 М. Среду заливали по 4 мл в стерильные пробирки, затем в них вносили 0,5 мл раствора, содержащего разные концентрации метронидазола: от 0,25 до 1000 мкг/мл (1 мг/мл). После этого в пробирки вносили 0,5 мл культуры возбудителя с заранее определенной концентрацией клеток (кл./мл). Kонтролем служила среда без препарата. Затем для создания анаэробных условий, необходимых для культивирования Т. vaginalis , в пробирки со средой вносили вазелиновое масло (толщина слоя 0,5 мм). Пробирки с исследуемым материалом инкубировали в термостате при температуре 37 о С. Учет результатов выполняли через 48 и 96 ч после посева. Чувствительность трихомонад к метронидазолу оценивали, определяя МПК, вызывающую иммобилизацию всех клеток Т. vaginalis . K лекарственно-устойчивым относили штаммы, у которых иммобилизация обнаруживалась при концентрациях метронидазола, превышающих 15 мкг/мл. Для исследования мы отобрали 15 штаммов T. vaginalis , которые содержали не менее 90% подвижных клеток. При анализе результатов проведенных исследований установлено, что у 6 лекарственно-устойчивых штаммов T. vaginalisметронидазол вызывал иммобилизацию клеток в концентрации от 125 до 250 мкг/мл. В группе 9 чувствительных штаммов иммобилизацию клеток трихомонад наблюдали при концентрациях метронидазола от 0,5 до 2 мкг/мл, более высокие концентрации препарата (от 15 мкг/мл и выше) вызывали лизис клеток возбудителя. В связи с широким распространением штаммов Т. vaginalis , устойчивых к метронидазолу, нами с октября 2006 по апрель 2007 г. была проведена оценка чувствительности 203 штаммов, выделенных от больных хроническим мочеполовым трихомонозом, к другим антипротозойным препаратам: производным 5-нитроимидазола пролонгированного действия (тинидазол, ниморазол, орнидазол и тенонитрозол), 4-аминохинолина (хлорохин, син. делагил) и нитрофурана (нифуратель, син. макмирор). Результаты продемонстрированы на рисунке. Для оценки чувствительности трихомонад мы использовали концентрации антипротозойных препаратов, соответствующие терапевтически эффективным. Среду разливали по 700 мкл в стерильные пробирки Эппендорф, а затем в них вносили 200 мкл раствора димексида (диметилсульфоксид), содержащего антипротозойный препарат в концентрации, в 5 раз превышающей терапевтически эффективную. В контрольную пробирку помещалось только 200 мкл димексида. Затем в пробирки осуществляли посев 100 мкл исследуемого материала. Учет результатов проводили через 48 и 96 ч после посева. K устойчивым были отнесены штаммы, концентрация клеток которых в опытных пробирках с антипротозойным препаратом составляла не менее 50% по сравнению с контролем. Воздействие препарата мы считали оптимальным при максимальном лизисе клеток трихомонад. Данные сравнительной оценки чувствительности штаммов трихомонад к антипротозойным препаратам приведены в таблице. Нами установлено, что к орнидазолу и тенонитрозолу оказались устойчивыми лишь 6,4 и 9,4% штаммов соответственно, что свидетельствует о достаточно высокой эффективности данных средств. Ниморазол и тинидазол проявили меньшую эффективность: к ним оказались устойчивы 14,3 и 18,3% штаммов соответственно. Таким образом, культуральный метод лабораторной диагностики мочеполового трихомониаза обладает достоверно более высокой чувствительностью по сравнению с наиболее широко используемым микроскопическим методом. Значительный уровень распространенности устойчивых штаммов свидетельствует о необходимости использования метода определения чувствительности T. vaginalis к антипротозойным препаратам с целью разработки рациональных схем этиотропной терапии. Согласно результатам исследования, наиболее эффективными препаратами для лечения трихомонадной инвазии являются орнидазол и тенонитрозол.

About the authors

Yu F Zakharkiv

A F Nikitin

K G Strel'tsova

A L Poznyak

R V Gudkov

S N Sidorchuk

References

Supplementary files