Particularities of clinical manifestations of infectious inflammatory process in women with uncomplicated and complicated pregnancy course

Full Text

На сегодняшний день в патогенезе многих заболеваний специалисты большое значение придают выраженности воспалительных реакций. Считают, что клиническими проявлениями воспалительных процессов у беременных могут быть угроза прерывания, фетоплацентарная недостаточность (ФПН) и врожденные пороки развития у плода (ВПР) [1, 2]. Поэтому интересно было проанализировать особенности клинических проявлений воспалительных процессов при разных осложнениях беременности. Цель исследования. Изучить особенности клинических проявлений инфекционно-воспалительного процесса у беременных с физиологическим и осложненным течением гестации. Материалы и методы. Проведен ретроспективный анализ амбулаторных карт наблюдения и историй родов у женщин с физиологической беременностью и разными осложнениями – 1-я группа (34 случая). Среди женщин с осложненной беременностью были больные с угрожающими выкидышами (УВ) в I триместре, получавшие в качестве лечения препараты магния и спазмолитики – 2-я группа (36 случаев); с угрозой прерывания во II, III триместрах – 3-я (51 случай); с диагностированной ФПН – 4-я (49 случаев); с гестозами (отеками, вызванными беременностью и нефропатией) – 5-я (49 случаев); родившие детей с фетопатиями и ВПР – 6-я (33 случая). Анализу подвергли особенности анамнеза и результаты стандартного обследования на основании общего анализа крови, сданной в I тримеcтре, по методике Кальф-Калифа [3] рассчитывали лейкоцитарный индекс интоксикации – ЛИИ (в условных единицах): (4 миелоциты* + 3 юные + 2 палочкоядерные + сегментоядерные) × (плазматические клетки + 1) ЛИИ = (лимфоциты + моноциты) × (эозинофилы + 1) *Все показатели приводятся в процентах. Нормативные показатели ЛИИ – от 0,62±0,09 до 1,6±0,5 условных единиц. Увеличение данного показателя свидетельствует о повышении уровня эндогенной интоксикации и активации процессов распада [4]. При обработке полученных данных вычисляли среднюю арифметическую вариационного ряда (М) и ошибку средней (m). Достоверность различий между независимыми группами оценивали по t-критерию Стьюдента. Взаимосвязь признаков определяли по коэффициенту линейной корреляции (r) Пирсона. Обработка результатов проводилась с помощью компьютерных программ Exell 2003 и Statistika 6.0. Полученные результаты. Возраст обследованных был от 18 до 41 года без статистически достоверных различий между группами. При анализе анамнестических данных оказалось, что все обследованные ранее болели инфекционно-воспалительными заболеваниями. Статистически достоверные различия в их частоте были выявлены только у обследованных 6-й группы, пациентки которой имели меньше экстрагенитальных инфекционно-воспалительных заболеваний – 54 (163,33%) случая, в 1-й группе – 73 (214,71%), p<0,05. Реже болели только острой респираторной вирусной инфекцией (ОРВИ) – 3 (9,09%) наблюдения, в 1-й группе 6 (17,67%), p<0,05 и чаще – разными экстрагенитальными инфекционно-воспалительными заболеваниями: ангинами, пиелонефритами, циститами, бронхитами и др. – 30 (90,91%) случаев, в 1-й группе – 28 (82,35%), p<0,05. Указания на генитальные инфекционно-воспалительные заболевания в анамнезе встречались достаточно часто без статистически достоверной разницы между группами – от 18 (35,29%) случаев, p<0,5 в 3-й до 42 (85,71%), p<0,5 в 5-й при 23 (67,65%) в 1-й группе. Не было выявлено существенных различий и в количестве сделанных медицинских абортов [их частота колебалась от 14 (28,57%) случаев, p<0,5 у пациенток 4-й группы до 29 (59,18%), p<0,5 в 5-й при 17 (50,00%) в 1-й], замерших беременностей – от 3 (6,12%), p<0,5 в 5-й группе до 7 (14,29%), p<0,5 в 4-й при 3 (8,82%) в 1-й. Обращало на себя внимание большее число самопроизвольных выкидышей у пациенток 2-й – 7 (19,44%), p<0,05 и 4-й – 17 (34,69%), p<0,001 групп, в 1-й 1 (2,94%) случай. Иными словами, все обследованные имели отягощенный инфекционно-воспалительными заболеваниями соматический и гинекологический анамнез с наименьшим общим количеством перенесенных экстрагенитальных инфекционно-воспалительных заболеваний у пациенток, родивших детей с ВПР. У всех женщин были в анамнезе медицинские аборты, замершие беременности и самопроизвольные выкидыши с наибольшим количеством самопроизвольных выкидышей у больных с угрозой прерывания в I триместре и у пациенток с ФПН. Результаты обследования при настоящей беременности показали, что клинические проявления и возбудителей инфекционно-воспалительного процесса также выявляли у всех обследованных. Клинические симптомы вульвовагинитов описывали в группе женщин и с физиологическим течением гестации – 11 (32,6%) случаев, и у больных с осложненным ее течением – от 6 (11,77%) случаев в 3-й группе, p<0,5 до 28 (57,14%) в 5-й, p<0,5; бактериурию выявляли у всех пациенток, реже в 6-й группе – 4 (12,12%) случая, в 1-й группе 13 (38,24%), p<0,05. Ряд возбудителей инфекционно-воспалительного процесса идентифицировали одинаково часто у всех обследованных, даже несколько чаще при неосложненной беременности: кандиды – от 6 (17,65%) случаев в 1-й группе до 14 (28,57%), p<0,5 в 4-й; условно-патогенную микрофлору в диагностически значимых титрах в моче – от 1 (3,03%) случая в 6-й, p<0,5 до 6 (11,77%) в 3-й, p<0,5 при 2 (5,88%) в 1-й группе; хламидии – от 3 (6,12%) случаев в 4-й группе, p<0,5 до 5 (15,15%) в 5-й, p<0,5 при 4 (11,74%) в 1-й группе. Других возбудителей воспалительного процесса выявляли преимущественно у пациенток с осложненным течением гестации, причем достоверно чаще у больных с гестозами и у женщин, родивших детей с ВПР: мико- и уреаплазмы в титре более 104 КОЕ/мл – от 6 (12,24%) случаев в 4-й, p<0,5 до 14 (28,57%), p<0,05 в 5-й группе и 11 (33,33%), p<0,001 в 6-й при 2 (5,88%) в 1-й группе; условно-патогенная микрофлора в диагностически значимых титрах из цервикального канала – от 1 (1,96%) наблюдения в 3-й, p<0,5 до 4 (12,12%), p<0,05 в 5-й группах и 6 (12,24%), p<0,05 в 6-й при отрицательных результатах в 1-й группе. ОРВИ при беременности болели обследованные в разных группах, незначительно чаще женщины с осложненным течением гестации – от 4 (11,77%) случаев в 1-й до 13 (25,49%), p<0,5 в 3-й группе. При анализе результатов обследования на вирусные инфекции достоверной разницы в титрах антител (IgG) к цитомегаловирусу (ЦМВ), вирусу простого герпеса (ВПГ) и краснухе между группами наблюдений выявить не удалось, но выявлены достоверные различия в индексах авидности (ИА) антител к вирусным инфекциям у обследованных 2-й группы – у них были повышены ИА IgG к ЦМВ – 86,23±14,61%, в 1-й группе – 70,30±14,74, p<0,05 и ВПГ – 99,46±9,69, в 1-й группе 89,9±11,81, p<0,05, что может быть проявлением реактивации или латентного течения этих инфекций. Таким образом, клинические проявления и возбудителей инфекционно-воспалительных процессов выявляли у обследованных разных групп. Ряд возбудителей воспалительных процессов идентифицировали практически одинаково часто при физиологическом и осложненном течении гестации (кандиды, условно-патогенная флора в моче и хламидии). Других выявляли чаще или только у женщин с осложненным течением беременности, причем с появлением статистически достоверной разницы в группах больных с гестозами и родивших детей с ВПР (мико- и уреаплазмы и условно-патогенную флору в цервикальном канале). Только у пациенток с угрозой прерывания в I триместре были выявлены косвенные признаки реактивации инфекций, вызванных ЦМВ и ВПГ. При сравнении ЛИИ оказалось, что наименьшие его показатели были у беременных 1-й (0,86±0,39 условных единиц) и 5-й (1,00±0,69 условных единиц, p>0,5) групп, незначительно повышенными во 2-й (1,41±1,11, p<0,05), 3-й (1,60±1,02, p<0,001) и 4-й (1,45±1,24, p<0,05) группах, наибольшими в 6-й (1,86±1,49, p<0,001) группе. Следовательно, более выраженную воспалительную реакцию в ранние сроки, оцениваемую по ЛИИ, имеют большинство женщин с осложненным течением беременности (исключение составляют больные с гестозами). Корреляционный анализ выявил средней силы связь между клиническими симптомами вульвовагинита и идентифицированными бактериальными возбудителями воспалительного процесса у женщин 1-й (r=+0,67), 3-й (r=+0,68), 5-й (r=+0,57), 4-й (r=+0,48) и 2-й (r=+0,42) групп и слабую (r=+0,11) у обследованных 6-й группы. Другими словами, у женщин с физиологическим течением беременности, угрозой прерывания в любом сроке, больных с гестозами и ФПН при наличии бактериальных возбудителей в большинстве случаев развивается типичный местный (урогенитальный) воспалительный процесс. У пациенток, родивших детей с ВПР, при наибольших показателях ЛИИ (при выраженной общей воспалительной реакции) чаще имеет место бессимптомное его течение, что, по-видимому, отражает особенности тканевых воспалительных реакций у этой категории пациенток. При анализе особенностей течения анализируемой беременности оказалось, что осложнения имели все обследованные. У женщин 1-й группы осложнения наблюдались достаточно часто – признаки инфекционно-воспалительного процесса, например, в этой группе при проведении ультрасонографии – ультразвуковом обследовании (УЗИ) выявляли в 7 (20,59%) случаях, но они не имели клинических проявлений и диагностировались только при проведении аппаратных методов исследования. Кроме того, эти осложнения практически не нарушали процессов нормального развития плода – в этой группе не было признаков перенесенной гипоксии у новорожденных, ВПР, масса тела детей была наибольшей (3612,48±392,16 г). Единственная описанная патология у новорожденных – это 2 (5,88%) случая задержки внутриутробного развития 1-й степени при массе тела у детей более 2 кг 800 г, не потребовавших лечения. Однако у этой категории пациенток обращала на себя внимание сравнительно большая частота видимых изменений в плаценте – наличие кальцинатов отмечено у 3 (8,82%) человек, некрозов и жировых перерождений – 5 (14,71%), т.е. 23,50% женщин с неосложненным течением гестации имели видимые морфологические изменения в последе. В остальных группах наблюдений описывали и клинические, и УЗИ с применением допплерометрии симптомы осложненного течения гестации. Кроме того, отмечали страдание плода: задержку внутриутробного развития – от 6 (11,76%) случаев, p<0,5 у детей участниц 2-й группы до 15 (30,61%), p<0,05 в 4-й; гипоксию у новорожденного – от 2 (5,55%) случаев, p<0,5 у пациенток 2-й до 9 (18,37%), p<0,05 у женщин 4-й группы; диагностировали ВПР – от 1 (2,8%) случая, p<0,5 во 2-й до 33 (100%), p<0,001 в 6-й группе. У всех детей от матерей с осложненным течением гестации масса тела была меньше, чем в 1-й группе, – от 3502,75±407,66 г, p<0,5 у женщин 2-й группы до 3226,00±533,75 г, p<0,001 в 4-й. Из всех групп наблюдений поражения плаценты незначительно чаще, чем в 1-й, описывали только у пациенток 4-й группы [здесь кальцинаты в плаценте выявлены у 17 (34,69%) человек, p<0,5; некрозы – у 4 (8,16%), p<0,5]. Реже всего поражения плаценты отмечали у женщин 6-й группы: кальцинаты – у 2 (3,1%), p<0,05; некрозов описано не было. Проведение корреляционного анализа показало, что в разных группах наблюдений различные инфекционные агенты имеют неодинаковое значение в формировании патологии плаценты и плода. У беременных 1-й группы выявлены корреляционные связи между формированием некрозов в плаценте и титром антител к ЦМВ (r=+0,56), краснухе (r=-0,39), высевом мико- и уреаплазм в титре более 104 КОЕ/мл (r=+0,36); кальцинатами в плаценте – высевом мико- и уреаплазм в диагностически значимом титре (r=+0,60), перенесенными при беременности ОРВИ (r=+0,50), титром антител к ВПГ (r=-0,46), хламидиозом (r=+0,36). Оказалось, что в этой группе наблюдений существуют прямые корреляционные связи между ЛИИ в I триместре и формированием кальцинатов (r=+0,37), ЛИИ в III триместре и образованием некрозов (r=+0,37) в плаценте. У женщин с физиологическим течением беременности многие инфекционные агенты, как бактерии, так и вирусы, могут вызывать поражение плаценты. Увеличивают риск поражения плаценты низкие титры антител к краснухе и ВПГ, что может быть проявлением особенности состояния или реагирования иммунной системы при беременности. В этой группе повышение активности воспалительных реакций и уровня эндогенной интоксикации, оцениваемые по ЛИИ, в I триместре коррелируют с формированием кальцинатов, а в III – с образованием некрозов в плаценте. У женщин 2-й группы в поражении плаценты (формировании кальцинатов) большее значение имели титры антител к краснухе (r=+0,48), а в поражении плода (формировании ВПР) – выявленные при беременности хламидиоз (r=+0,42), бактериальные инфекции (r=+0,36) и перенесенные ОРВИ (r=+0,27). В этой группе наблюдений повышение ЛИИ не коррелировало с развитием изменений в плаценте, но имело связь с поражением плода – выявлена корреляция между ВПР и ЛИИ в I (r=+0,48) и III (r=+0,54) триместрах, также был обнаружен один случай синдрома Дауна в сочетании с врожденным пороком сердца (дефект межжелудочковой перегородки). У женщин 3-й группы в развитии поражений плаценты – образовании кальцинатов – большее значение имел ИА антител к ЦМВ (r=-0,62) и хламидиоз (r=+0,51); некрозов – титр антител к краснухе (r=-0,37). Формирование ВПР у плода в большей степени зависело от высева мико- и уреаплазм в диагностически значимом титре (r=+0,36). Показатели ЛИИ в I триместре имели выраженную корреляционную связь с формированием ВПР у плода (r=+0,67), а во II – с образованием кальцинатов в плаценте (r=+0,35). У пациенток 4-й группы формирование кальцинатов в плаценте коррелировало с титром антител к ЦМВ (r=-0,32); поражение плода – титром антител к краснухе (r=-0,27) и ВПГ (r=+0,23); ЛИИ в I триместре – с формированием ВПР у плода (r=+0,67), а ЛИИ во II триместре – с образованием кальцинатов (r=+0,35). У больных 5-й группы наличие в плаценте кальцинатов в большей степени зависело от титра антител к ЦМВ (r=-0,26); некрозов – от титра антител к ВПГ (r=+0,71), краснухе (r=-0,55), авидности антител к краснухе (r=-0,58), выявленных бактериальных возбудителей (r=+0,43); ВПР у плода – от титра антител к ЦМВ (r=+0,59), ВПГ (r=-0,38), наличия клинических проявлений вульвовагинита (r=+0,46), выявленных бактериальных возбудителей (r=+0,41), авидности антител к краснухе (r=-0,39). ЛИИ в I триместре коррелировал с формированием кальцинатов в плаценте, во II – формированием ВПР у плода (r=+0,58), а в III – и с формированием некрозов в плаценте (r=+0,41), и с ВПР у новорожденного (r=+0,36) – в этой группе было по одному случаю миокардиодистрофии у плода и врожденного порока сердца (дефект межпредсердной перегородки). У беременных 6-й группы наличие кальцинатов в плаценте в большей степени зависело от высева мико- и уреаплазм в диагностически значимом титре (r=+0,29) и авидности антител к ЦМВ (r=+0,24), формирование ВПР у плода – от авидности антител к ВПГ (r=+0,91), высева мико- и уреаплазм в титре более 104 КОЕ/мл (r=+0,55). ЛИИ в I триместре имел корреляционную связь средней силы с формированием ВПР (r=+0,41), а во II – сильную связь с формированием кальцинатов в плаценте (r=+0,76). У женщин с осложненным течением беременности так же, как и у обследованных с физиологическим течением гестации, морфологические изменения в плаценте могут вызывать разные инфекционные агенты как бактерии, так и вирусы. Кроме того, у этой категории пациенток при воспалении помимо поражения плаценты происходит еще и поражение плода. При разных осложнениях гестации значимость разных возбудителей в развитии поражений различна – у женщин с угрозой прерывания в I триместре большее значение имеет краснуха, выявленные при беременности бактериальные инфекции, хламидиоз и перенесенные ОРВИ; у пациенток с угрозой прерывания во II, III триместрах – мико- и уреаплазмы, высеянные в диагностически значимом титре, и хламидии; у больных с ФПН – ВПГ; у пациенток с гестозами – ЦМВ, ВПГ, выявленные бактериальные инфекции при беременности, мико- и уреаплазмы. У беременных, родивших детей с ВПР, – ЦМВ, ВПГ и мико- и уреаплазмы в диагностически значимых титрах. Обращает на себя внимание, что увеличивают риск поражения плаценты и плода низкие титры и низкая авидность антител к вирусным инфекциям. Таким образом, при физиологическом течении беременности бактериальные возбудители в большинстве случаев вызывают типичную местную воспалительную реакцию; действие инфекционных агентов и эндогенная интоксикация приводят к поражению только плаценты, что в I триместре проявляется формированием кальцинатов, а в III – некрозов. При этом формируются полноценные компенсаторные механизмы и практически не нарушается развитие плода. Следовательно, для здоровых беременных характерна минимальная по силе системная воспалительная реакция, достаточно выраженные локальные воспалительные реакции без нарушения тканевых функций, надежно действующие с ранних сроков беременности местные механизмы защиты плода от повреждений при инфекционно-воспалительных процессах. У женщин с осложненным течением гестации действие инфекционных агентов также приводит к появлению анатомических изменений в плаценте. Кроме этого, у пациенток с любыми осложнениями беременности происходит еще и нарушение функции плаценты – синдром задержки развития плода (СЗРП), регистрируются случаи угрожающей асфиксии плода в родах и признаки гипоксии у новорожденных. Выявленные положительные корреляции между инфекционными агентами, ЛИИ и поражением плаценты и ВПР у ребенка позволяют говорить о том, что инфекционно-воспалительные процессы у женщин с осложненным течением гестации приводят еще и к поражению плода. Следовательно, у женщин с осложненным течением беременности действие инфекции и повышение степени эндогенной интоксикации обусловливают развитие анатомических поражений плаценты и плода, функциональных нарушений в матке и структурах фетоплацентарного комплекса (развитие клинических симптомов угрозы прерывания беременности, ФПН, СЗРП, угрожающей асфиксии плода в родах и гипоксии у новорожденного). Для всех женщин с осложненным течением беременности при инфекционно-воспалительных процессах характерны развитие более выраженных по силе и распространенности воспалительных реакций, появление клинических симптомов, нарушения тканевых функций (повышение тонуса матки, формирование плацентарной недостаточности), недостаточно эффективные местные механизмы защиты плода от повреждения. Кроме этого, у женщин с разными осложнениями беременности есть свои особенности воспалительных реакций. У пациенток с угрозой прерывания в любом сроке образование кальцинатов и некрозов в плаценте коррелирует с возбудителями воспалительного процесса и не зависит от ЛИИ, а наличие бактериальных возбудителей имеет средней силы связь с клиническими симптомами урогенитального воспалительного процесса. Следовательно, для этой категории пациенток характерно малосимптомное течение воспалительного процесса (развитие тяжелых морфологических изменений в тканях при минимальной системной и умеренно выраженной местной воспалительной реакции). У пациенток, родивших детей с ВПР, обращают на себя внимание максимальные количественные характеристики общей воспалительной реакции и степени эндогенной интоксикации в I триместре, оцениваемые по ЛИИ, при самом низком коэффициенте корреляции между выявленными бактериальными возбудителями и клиническими симптомами урогенитального воспалительного процесса. Для этой категории пациенток характерны выраженные общие воспалительные реакции, минимальные местные проявления воспалительного процесса при развитии тяжелых морфологических изменений в тканях (формирование ВПР у плода). У больных с ФПН и женщин, родивших детей с ВПР, образование кальцинатов в плаценте коррелирует с ЛИИ не в I, а во II триместре, а ЛИИ в I триместре коррелирует с поражением плода. Другими словами, у этой категории пациенток эффективные местные механизмы защиты плода от повреждения инфекционными агентами формируются только ко II триместру. У большинства женщин с осложненным течением беременности (исключение составляют пациентки с гестозами) выявлены корреляции между ЛИИ в I триместре и формированием ВПР у плода. Следовательно, у беременных с угрозой прерывания в I триместре, у пациенток, имеющих в анамнезе преждевременные роды, ФПН и рождение детей с ВПР, воспалительные процессы любой этиологии в ранние сроки могут привести к поражению плода. Поэтому у этих категорий пациенток оправдано безотлагательное, с ранних сроков гестации, проведение этиотропной (антибактериальной, противовирусной) терапии при выявлении клинических симптомов или идентифицированных возбудителях воспалительного процесса. Выводы 1. Указания на перенесенные экстрагенитальные и генитальные инфекционно-воспалительные заболевания в анамнезе, клинические проявления и возбудители инфекционно-воспалительных процессов могут быть выявлены у женщин и с физиологическим, и с осложненным течением гестации. Поэтому перечисленные факторы не могут достоверно прогнозировать риск развития осложнений при настоящей беременности. 2. При беременности клинические симптомы и возбудители урогенитального инфекционно-воспалительного процесса могут быть идентифицированы у женщин и с физиологическим, и с осложненным течением гестации. Ряд возбудителей воспалительного процесса (кандиды, условно-патогенная флора в моче в диагностически значимых титрах и хламидии) одинаково часто выявляют у всех беременных; других (мико- и уреаплазмы, условно-патогенная микрофлора в цервикальном канале в диагностически значимом титре) – достоверно чаще при осложненном течении гестации. 3. Для больных с УВ в I триместре характерно повышение ИА антител к ЦМВ и ВПГ, что может быть признаком реактивации этих инфекций. 4. У пациенток с осложненным течением беременности (исключение составляют больные с гестозами) имеют место более выраженные воспалительные реакции и большая степень эндогенной интоксикации, оцениваемая по ЛИИ. Поэтому возможно использование этого показателя для прогнозирования развития основных осложнений гестации. 5. УЗИ-признаки неблагополучного течения беременности (участки сокращенного миометрия, низкое расположение хориона, многоводие, косвенные симптомы внутриутробной инфекции) практически одинаково часто выявляют и при физиологическом, и при осложненном течении гестации. Клинические симптомы (угрозы прерывания, угрожающая асфиксия плода в родах, гипоксия у новорожденных) достоверно чаще имеют пациентки с осложненным течением беременности, поэтому именно появление клинических симптомов характеризует осложненное течение беременности. 6. У беременных генитальные инфекции и воспалительные процессы приводят к развитию деструктивно-дистрофических (некрозы, кальцинаты, жировые перерождения в плаценте, ВПР у плода) и функциональных (угрозы прерывания, ФПН, СЗРП, угрожающая асфиксия плода в родах, гипоксия у новорожденного) нарушений в структурах фетоплацентарного комплекса, тяжесть и выраженность которых обусловлены особенностями реагирования организма. 7. У здоровых женщин патогенное действие инфекционных агентов во время беременности обусловливает только поражение плаценты. Морфологические изменения плаценты (формирование кальцинатов и некрозов) не приводят к нарушению ее функции, т.е. не развиваются клинические симптомы ФПН и не нарушается развитие плода. 8. При осложненном течении беременности воспалительные процессы приводят к формированию морфологических изменений в плаценте и у плода (ВПР), функциональных нарушений в плаценте (гипоксии и СЗРП) и обусловливают развитие клинических симптомов неблагополучного течения гестации (угрозы прерывания, ФПН, гипоксии у новорожденного). 9. Большинство пациенток с осложненным течением беременности (исключение составляют больные с гестозами) имеют несостоятельные местные механизмы защиты плода в ранние сроки от повреждения при инфекционно-воспалительных процессах. Поэтому у беременных с угрозой прерывания в I триместре, женщин, имеющих в анамнезе преждевременные роды, ФПН и рождение детей с ВПР, оправдано безотлагательное, с ранних сроков, проведение этиотропной (антибактериальной, противовирусной) и патогенетической (дезинтоксикационной) терапии при выявлении клинических симптомов и возбудителей воспалительного процесса, появлении косвенных признаков повышения активности воспалительных реакций (ЛИИ более 1,5 условных единиц).

About the authors

V V Skryabina

Email: skryabina-vv@mail.ru

References

Supplementary files