Immunohistochemical examination of placenta in women with thrombophilia and pregnancy loss summary


Cite item

Full Text

Abstract

The immunohistochemical study of angiogenesis, anticoagulative protection, cell death and proliferation in placental tissue in pregnant women with thrombophilia and pregnancy loss was carried out in the following research. The study included 142 pregnant women.The study group included 56 pregnant women, who were, from the first trimester prescribed Curantyl® (dipyridamole) and Fraxiparine® (nadroparine) in order to correct the hemostatic disorders. As for the comparison group (consisting of 50 pregnant women), standard therapy aimed at the continuation of the pregnancy was carried out; the control group consisted of 36 pregnant women. A significantly lower incidence of pregnancy loss in the primary (3,57%) and the control group (0%) compared with the comparison group (18%; p<0,05) was revealed.After correction of violations in blood coagulation system the annexin V expression area in syncytiotrophoblast and expression of vascular endothelial factor in the stroma and vascular endothelium of the villi were much higher than in the comparison group (28,80±2,76% and 22,06±1,93%, p<0,05; 17,38±4,87% and 1,08±0,46% respectively, p<0,01). These immunohistochemical studies have demonstrated the positive effects of the therapy on the angiogenesis process, proliferation and anticoagulant protection in placentic tissue. It enables us to justify the feasibility of dipyridamole and nadroparine in pregnant women with thrombophilia and pregnancy loss.

Full Text

Введение Невынашивание беременности не перестает быть актуальной проблемой современного акушерства и требует комплексного подхода к диагностике и лечению с приме- нением высокотехнологичных методов. У 5% женщин ре- продуктивного возраста в анамнезе имеются 2 или более выкидышей, у 1% женщин – 3 и более [30]. Частота невына- шивания составляет до 20% среди всех случаев беременно- сти [10]. Частота привычных выкидышей, особенно на ран- них сроках, остается стабильной и достаточно высокой – от 2% в популяции до 15–55% в разных группах больных [2]. Привычное невынашивание беременности встречается у 1–3% пар [48]. В течение последних 20 лет в мире активно изучается вклад тромбофилии в развитие патологических процессов, приводящих к невынашиванию, плацентарной недоста- точности (ПН), гестозу. Мутации фактора V Lieden (FVLei- den), гена протромбина, метилентетрагидрофолатредук- тазы (MTHFR С677Т) определены по результатам ряда ис- следований как наиболее неблагоприятные в отношении прогноза развития осложнений беременности [3, 4, 14, 15, 29, 33, 37, 50]. В литературе обсуждается не только значение отдельных видов тромбофилических мутаций, но также роль их количества и сочетаний у конкретной пациентки. По данным Т.Е.Матвеевой и соавт. (2003 г.), при ранних вы- кидышах тромбофилия выявлялась в 67%, мультигенная тромбофилия – в 18%, антифосфолипидный синдром – в 42%, полиморфизм гена MTHFR С677Т – в 42%, мутация FVLeiden – в 12% [5]. В некоторых работах изучались такие маркеры тромбофилии, как дефицит антитромбина, про- теина С, протеина S и антифосфолипидный синдром [16, 33]. В крупном исследовании, включавшем более 1 тыс. женщин, выявлена большая связь привычного невынаши- вания с наличием приобретенной резистентности к про- теину С, нежели с наличием мутации FVLeiden [28]. Неодно- значные выводы о степени патологического влияния той или иной мутации обращают внимание на важность оценки фенотипических проявлений генетических анома- лий, а именно на состояние показателей системы гемостаза у носителей мутаций. Процесс тромбообразования может быть вовлечен в развитие таких осложнений беременности, как привыч- ное невынашивание, гестоз, задержка внутриутробного развития плода (ЗВРП), преждевременная отслойка нор- мально расположенной плаценты за счет нарушения пла- центарной перфузии [39]. В связи с этим тонкий баланс факторов свертывания и антикоагулянтной защиты мо- жет играть критическую роль на уровне плацентарного кровотока. Адекватное развитие и дифференцировка трофобласта являются результатом, с одной стороны, воздействия мате- ринской системы гуморальных факторов, в том числе коа- гуляционных, а с другой – функцией самого трофобласта, обладающего потенциалом регулировать свертывающую систему. Наряду с изучением влияния факторов свертыва- ния на процесс плацентации предметом исследований в последнее время является роль тромбоцитов в регуляции локального гемостаза в формирующейся плаценте. Активи- рованные тромбоциты также влияют на развитие и функ- цию плаценты, высвобождая биогенные пептиды, такие, как сосудистый эндотелиальный фактор роста (СЭФР), тромбоцитарный фактор роста-b, кроме того, тромбоциты могут напрямую взаимодействовать с трофобластом [43]. В исследовании Y.Sato и соавт. (2005 г.) показано, что фак- торы, выделяемые тромбоцитами, могут влиять на мигра- цию и дифференцировку клеток культуры человеческого вневорсинчатого трофобласта [44]. На основании экспери- ментальных работ сделано предположение, что возможной причиной развития ПН является активация тромбоцитов, опосредованная тромбином [51]. Исследование плаценты у пациенток с тромбофилией нацелено на поиск отражения патофизиологических про- цессов, развивающихся при активации прокоагулянтного звена гемостаза. Гистоморфологические исследования плаценты у женщин с привычным невынашиванием и тромбофилией относятся к недавнему времени [40, 41], и во многих из них отмечены гиповаскуляризация ворсин, множественные тромбозы, инфаркты, фиброз и патологи- ческие изменения сосудов децидуальной оболочки. Связь нарушений локальной коагуляции и развития ПН подчеркивается в работе Г.М.Савельевой и соавт. (1991 г.), где говорится о том, что образование интраплацентарных тромбов приводит к острой ПН [7]. Формирование плаценты – важнейший этап, определяю- щий течение беременности. В связи с этим лечебные меро- приятия, направленные на предотвращение осложнений беременности, можно считать своевременными, если они проводятся с раннего срока беременности. Основные направления терапии, корригирующей гемо- стаз, – это применение антикоагулянтов (нефракциони- рованный гепарин, низкомолекулярные гепарины) и ан- тиагрегантов (ацетилсалициловая кислота, дипирида- мол). Было показано, что гепарин препятствует апоптозу в культуре первичного ворсинчатого трофобласта I триме- стра в ответ на воздействие провоспалительных цитокинов g-интерферона и фактора некроза опухолей a, ингибито- ров киназ широкого спектра и тромбина. Способность ге- парина противодействовать клеточной гибели, стимулиро- ванной разными сигналами апоптоза, говорит о возмож- ном его влиянии как фактора, поддерживающего существо- вание трофобласта человека. Гепарин активирует множе- ственные противоапоптозные пути в трофобласте чело- века. Эти данные указывают на то, что гепарин может быть эффективен для ведения пациенток с беременностью по- вышенного риска даже в отсутствие тромбофилических расстройств [31]. В ряде работ показано, что применение низкомолекуляр- ного гепарина при беременности эффективно для улучше- ния ее исходов при невынашивании и тромбофилии [5, 13, 17, 19, 20–22, 24, 35, 49]. Патогенетическое обоснование эффективности данной терапии, по-видимому, состоит в предотвращении локальной активации коагуляции на уровне плацентарного кровообращения. Исследование Целью настоящего исследования было изучить особенности плацентарной ткани с применением иммуногистохимических (ИГХ) методов у беременных с невынашива- нием и тромбофилией при проведении коррекции нару- шений гемостаза с применением дипиридамола и надропа- рина с I триместра беременности. Методы Клинико-лабораторное обследование проводилось в ФГБУ НИИ АГ им. Д.О.Отта СЗО РАМН. В исследование были включены 142 беременные, из них 106 пациенток с невы- нашиванием беременности и 36 – не имевших в анамнезе случаев невынашивания, с физиологическим течением бе- ременности. В основную группу и группу сравнения вошли беременные, в анамнезе у которых было от 1 до 7 потерь беременности. Количество предшествовавших случаев са- мопроизвольного прерывания беременности в основной группе и группе сравнения достоверно не различалось. Ча- стота срочных, преждевременных родов, антенатальной и интранатальной гибели плода, ранней неонатальной ги- бели плода, преждевременной отслойки нормально распо- ложенной плаценты в анамнезе также была сопоставимой в исследуемых группах. 106 беременных с невынашиванием были разделены на 2 группы: основную, в которую вошли 56 женщин, и группу сравнения, которую составили 50 че- ловек. В группе сравнения проводилась терапия, направ- ленная на сохранение беременности без применения пре- паратов, корригирующих гемостаз. 36 беременных, не имевших в анамнезе случаев невынашивания, с физиологи- чески протекавшей беременностью, составили контроль- ную группу. Беременные всех групп были включены в ис- следование в I триместре беременности, когда выполня- лись клинико-лабораторное обследование в стандартном объеме и оценка лабораторных параметров системы гемо- стаза, по итогам которых в основной группе назначалась терапия, направленная на коррекцию нарушений в сверты- вающей системе крови. Возраст беременных варьировал от 20 до 40 лет, был сопоставим во всех группах и составил в основной группе 30,66±0,63 года, в группе сравнения – 31,04±0,66 года, в контрольной группе – 31,89±0,86 года. Всем 142 беременным выполнено молекулярно-генетиче- ское исследование, выявляющее наследственные наруше- ния системы гемостаза: мутации в гене FVLeiden, протромбина 20210 G→А, полиморфизмы в гене ингибитора акти- ватора плазминогена 1-го типа (PAI-1) 675 4G→5G, в гене фибриногена 455 G→А, в гене гликопротеина IIIa 1565Т→С, в гене MTHFR 677С→Т, в гене тканевого активатора плазми- ногена (PLAT). Оценку степени риска осложнений беременности при наличии тромбофилических полиморфизмов проводили при помощи балльной шкалы степени риска акушерских осложнений при наличии тромбофилических полимор- физмов [12]. Назначение терапии антиагрегантами и/или антикоагулянтами и мониторинг данной терапии (конт- роль коагулограммы, агрегационной активности тромбо- цитов, D-димера, гомоцистеина) проводились в соответ- ствии с алгоритмом диагностических и лечебных меро- приятий при наследственной тромбофилии, разработан- ным в ФГБУ НИИ АГ им. Д.О.Отта [12]. Коррекция наруше- ний в системе гемостаза назначалась с момента диагно- стики беременности с применением антиагрегантной те- рапии – дипиридамола (Курантил®) и/или антикоагулянт- ной терапии – надропарин кальция (Фраксипарин®). Средний срок беременности на момент включения в ис- следование составил в основной группе 7,70±0,10 нед, в группе сравнения – 7,61±0,13 нед, в контрольной группе – 8,08±0,14 нед. 49 пациенток основной группы получали комбинированную терапию: дипиридамол и надропарин, 3 пациентки получали только дипиридамол, 4 пациенткам проводилось лечение только надропарином. Дипиридамол назначался в таблетках по 25 мг 3 раза в сутки в течение 21 дня с последующим контролем агрегационной активности тромбоцитов. Надропарин назначался подкожно в дозе 0,3 мл 1 раз в сутки при массе тела беременной менее 50 кг, в дозе 0,3 мл 2 раза в сутки каждые 12 ч при массе тела от 50 до 70 кг, в дозе 0,3 мл утром и 0,6 мл вечером или 0,6 мл че- рез 12 ч при массе тела более 70 кг. Минимальная продол- жительность курса надропарина составляла 21 день. Конт- роль лечения осуществлялся путем оценки следующих па- раметров: D-димера, активированного парциального тром- бопластинового времени, фибриногена, растворимых фибрин-мономерных комплексов, индуцированной агре- гации тромбоцитов с аденозиндифосфатом (в концентра- ции 2 и 0,2 мкм). Проводились оценка исходов беременно- сти, гистологическое и ИГХ-исследование плацент во всех группах. Исследование на наследственную тромбофилию прово- дилось методом полимеразной цепной реакции с помо- щью биочипа, разработанного лабораторией пренаталь- ной диагностики врожденных и наследственных заболева- ний ФГБУ НИИ АГ им. Д.О.Отта СЗО РАМН совместно с ФГБУ Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгель- гардта РАН. Гистологическое исследование выполнено у 36 женщин основной группы, 31 – группы сравнения и 32 – контроль- ной группы. Гестационный срок на момент гистологиче- ского исследования варьировал от 38 до 40 нед во всех из- учаемых группах. Для гистологического исследования ткань плаценты фиксировали, обезвоживали в автоматиче- ской станции Leica TP1020 и заливали в парафин согласно стандартной гистологической схеме c последующей окра- ской гематоксилин-эозином. ИГХ-исследование плацент выполнено у 8 женщин из ос- новной группы, 7 – из группы сравнения и 7 – из контроль- ной группы, получавших комбинированную терапию (Курантил® и Фраксипарин®). Пролиферативная актив- ность клеток оценивалась по экспрессии протеина Ki-67 с использованием антител фирмы Dako (Дания). Экспрессия маркера MCL-1 определялась с применением антител фирмы Novocastra (Германия), экспрессия маркера апоп- тоза р-53 изучалась с помощью антител фирмы Dako (Да- ния). Экспрессия маркера ангиогенеза СЭФР определялась с помощью антител фирмы Dako (Дания). Экспрессия ан- нексина V выявлялась с применением антител фирмы Abcam (Великобритания). ИГХ-исследование проводили на парафиновых срезах. Срезы ткани толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). В ка- честве системы визуализации использовали набор, содер- жащий биотинилированные козьи антикроличьи и анти- мышиные антитела, стрептавидин, конъюгированный с пе- роксидазой хрена и 3,3’-диаминобензидин. Для проведения ИГХ-реакции использовали стандарт- ный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цит- ратном буфере рН 7,6. Микропрепараты исследовали под микроскопом Nicon с настройкой освещения по Келлеру при увеличении ×40 и ×100 с целью получения общего представления о результа- тах ИГХ-реакции. Количественную оценку результатов ИГХ-реакции проводили на микрофотографиях, получен- ных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4, программного обес- печения «АСТ-1» версии 2.12. Выполнялась фотосъемка 5 участков каждого препарата. Дальнейшее количественное исследование проводили с помощью программы компью- терного анализа изображений «Морфология 5.0» (Видео- Тест, Россия). При оценке экспрессии изучаемых маркеров использовались такие параметры, как площадь окрашен- ных участков и их оптическая плотность. Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы Microsoft Excel 2007 (Mi- crosoft Corporation, США) и Statistica v.6.1 (Statsoft Inc., Tulsa, США). Результаты В группах беременных с невынашиванием – основной и группе сравнения – наследственная тромбофилия вы- явлена у 100% беременных, тогда как в контрольной группе частота ее составила 75% случаев и была достоверно более низкой по сравнению с группами с невынашиванием. Мультигенная тромбофилия (наличие 2 и более полимор- физмов) встречалась у 45 пациенток в основной группе (80,36%) и у 37 беременных в группе сравнения (74%), что также было достоверно чаще по сравнению с контрольной группой, где частота ее обнаружения составила 47,22%. Об- щая частота наследственной и мультигенной тромбофи- лии в основной группе и группе сравнения не отличалась. При оценке частоты выявления каждого полиморфизма в отдельности обнаружено, что частота встречаемости по- лиморфизмов генов, отвечающих за нарушения в системе фибринолиза – PAI-1 и PLAT, при невынашивании досто- верно превышала таковую в контрольной группе (78,30 и 44,34%; 58,33 и 19,44% соответственно; р<0,05). По частоте остальных полиморфизмов достоверных различий между беременными с невынашиванием и контрольной группой выявлено не было. Выявлена достоверно более высокая частота потери бе- ременности (самопроизвольный выкидыш или неразви- вающаяся беременность) в группе сравнения (18%), чем в основной (3,57%) и контрольной группе (0%; р<0,05). Ча- стота срочных родов в основной группе (89,29%) значи- тельно превышала таковую в группе сравнения (70%; р<0,05) и достоверно не отличалась от частоты срочных родов в контрольной группе (100%). ЗВРП выявлялась в группе сравнения с частотой 12,20% и была достоверно выше, чем в основной группе (р<0,05), где случаев ЗВРП не было. ЗВРП 1-й степени установлена у 7,32% новорожден- ных, 2-й степени – у 4,88%. ПН по данным гистологического исследования диагно- стирована достоверно чаще в группе сравнения (35,48%), таблица 1. Частота Пн Пн основная группа (n=36) Группа сравнения (n=31) Контрольная группа (n=32) абс. % абс. % абс. % наличие Пн 4 11,11 11* 35,48 3 9,38 вид Пн Хроническая компенсированная 1 2,78 4 12,90 3 9,38 Хроническая субкомпенсированная 2 5,56 4* 12,90 0 0 Хроническая декомпенсированная 0 0 3 9,68 0 0 *р<0,05 по сравнению с контрольной группой. таблица 2. Экспрессия аннексина v в плаценте в обследованных группах Экспрессия аннексина v основная группа (n=8) Группа сравнения (n=7) Контрольная группа (n=7) Площадь окрашенных участков, % 28,80±2,76* 22,06±1,93* 38,95±2,52 Оптическая плотность окрашивания, у.е. 0,502±0,02 0,358±0,02*** 0,571±0,03 *р<0,05 по сравнению с контрольной группой; ***р<0,001 по сравнению с контрольной группой. рис. 1. Экспрессия аннексина v в синцитиотрофобласте ворсин хориона в обследованных группах: а – основная группа; б – группа сравнения; в – контрольная группа. иГх-метод. чем в основной (11,11%; р<0,05) и контрольной группах (9,38%; р<0,05). Декомпенсированная хроническая ПН об- наружена лишь в группе сравнения (9,68%). Циркуляторные нарушения, инфаркты плацентарной ткани, воспалительные изменения встречались в основной группе, группе сравнения и контрольной группе с сопостави- мой частотой. Степень отложения фибриноида в строме вор- син, в межворсинчатом и субхориальном пространстве также не имела достоверных различий в исследуемых груп- пах (табл. 1). При ИГХ-исследовании плацент экспрессия аннексина V, плацентарного антикоагулянтного протеина, предотвра- щающего мембранозависимую активацию коагуляции ма- теринской крови, выявлялась в синцитиотрофобласте вор- син всех типов. При оценке экспрессии аннексина V вы- явлено, что площадь окрашенных участков ворсин была значительно больше в контрольной группе (38,95±2,52%) по сравнению с основной (28,80±2,76%) и группой сравне- ния (22,06±1,93%). В основной группе данный показатель значительно превышал таковой в группе сравнения, в кото- рой отсутствовала коррекция нарушений в системе гемо- стаза (28,80±2,76 и 22,06±1,93% соответственно; р<0,05). Оптическая плотность окрашивания в основной (0,502±0,02 у.е.) и контрольной группе (0,571±0,03 у.е.) также превышала показатель группы сравнения (0,358±0,02 у.е.; р<0,001), что отражено в табл. 2; рис. 1. Экспрессия маркера клеточной пролиферации Кi-67 вы- являлась в ядрах синцитиотрофобласта, клеток стромы вор- син, эндотелия сосудов ворсин. Наименьшая площадь окраски ядер данным маркером имелась в группе сравнения (1,25±0,34%) при сопоставлении с группой контроля (8,01±1,22%) и основной группой (9,15±2,19%; р<0,001). Опти- ческая плотность окрашивания была значительно выше в ос- новной группе (0,511±0,02 у.е.) и контрольной (0,554±0,04 у.е.) при сопоставлении с группой сравнения (0,313±0,02 у.е.; р<0,001). Величина показателя достоверно не отличалась в ос- новной и контрольной группах, как показано в табл. 3; рис. 2. Экспрессия маркера апоптоза р53 выявлялась в синци- тиотрофобласте и строме ворсин во всех исследуемых группах. Отмечено равномерное распределение экспрес- сии данного маркера между стромой и синцитиотрофо- бластом. Площадь экспрессии маркера апоптоза р53 и оп- тическая плотность окрашивания не различались в изучае- мых группах, как показано в табл. 4; рис. 3. Экспрессия маркера MCL-1, ингибирующего апоптоз, вы- являлась в клетках стромы ворсин и синцитиотрофобласте. Во всех исследуемых группах экспрессия данного маркера преобладала в синцитиотрофобласте по сравнению с экс- прессией в строме ворсин. При оценке экспрессии MCL-1 выявлено отсутствие достоверной разницы в площади окрашенных участков ворсин между исследуемыми груп- пами, как показано в табл. 5.; рис. 4. При анализе оптиче- ской плотности окраски выявлено, что в основной (0,437±0,03 у.е.) и контрольной группах (0,520±0,03 у.е.) данный параметр был выражен значительно больше, чем в группе сравнения (0,304±0,02 у.е.; р<0,05 и р<0,01 соответ- ственно). В основной и контрольной группах оптическая плотность окраски достоверно не отличалась. При исследовании экспрессии СЭФР, отражающего про- цесс ангиогенеза, выявлено, что площадь окрашенных уча- стков ворсин была наибольшей в контрольной группе (36,25±6,88%) и достоверно превышала таковую в основ- ной (17,38±4,87%; р<0,05) и в группе сравнения (1,08±0,46%; р<0,01). В основной группе значение данного показателя также было достоверно больше, чем в группе сравнения (17,38±4,87 и 1,08±0,46% соответственно; р<0,01). Экспрес- сия СЭФР обнаружена в строме ворсин и в области эндоте- лия сосудов ворсин. Оптическая плотность экспрессии СЭФР в группе сравнения (0,273±0,02 у.е.) была значи- тельно меньше по сравнению с таковой в основной (0,519±0,06 у.е.; р<0,05) и контрольной группах (0,480±0,06 у.е.; р<0,01). Оптическая плотность экспрессии СЭФР в ос- новной и контрольной группах достоверно не отличалась, что продемонстрировано в табл. 6; рис. 5. Обсуждение Данные о преобладании частоты наследственной, а также мультигенной тромбофилии у женщин с невынаши- ванием беременности по сравнению с беременными конт- рольной группы согласуются с результатами ранее прове- денных исследований [36]. В литературе неоднократно ука- зывалось на повышение частоты полиморфизма PAI-1 при невынашивании беременности [18, 45]. Полученные нами данные о частоте гомозиготного полиморфизма PAI-1 при невынашивании (26,42%) сходны с результатами работы M.Ааrabi и соавт. (2010 г.), в которой частота его составила 18,50% [45]. Сочетание полиморфизмов PAI-1 и PLAT, пре- обладающее при невынашивании, по сравнению с конт- рольной группой по данным нашего исследования, воз- можно, усиливает патологическое воздействие на систему фибринолиза. В литературе неоднократно сообщалось, что дипирида- мол является эффективным антиагрегантом при использо- вании его в комплексной терапии и профилактике ПН [1, 11]. Подчеркивалось преимущество дипиридамола в связи с вы- соким профилем безопастности на ранних сроках беремен- ности [6], управляемостью антиагрегантного эффекта [11], отмечена также возможность использования дипиридамола в качестве модулятора ангиогенеза и кровотока в плаценте [9]. Полученные нами данные о значимом снижении частоты таблица 3. Экспрессия Кi-67 в плаценте в обследованных группах Экспрессия Кi-67 основная группа (n=8) Группа сравнения (n=7) Контрольная группа (n=7) Площадь окрашенных участков, % 9,15±2,19*** 1,25±0,34*** 8,01±1,22 Оптическая плотность окрашивания, у.е. 0,511±0,02 0,313±0,02*** 0,554±0,04 ***р<0,001 по сравнению с контрольной группой. таблица 4. Экспрессия р53 в плаценте в обследованных группах Экспрессия р53 основная группа (n=8) Группа сравнения (n=7) Контрольная группа (n=7) р Площадь окрашенных участков, % 11,32±3,22 22,71±5,42 14,00±2,66 >0,05 Оптическая плотность окрашивания, у.е. 0,459±0,02 0,482±0,032 0,421±0,06 >0,05 таблица 5. Экспрессия mCl-1 в плаценте в обследованных группах Экспрессия мCl-1 основная группа (n=8) Группа сравнения (n=7) Контрольная группа (n=7) Площадь окрашенных участков, % 33,39±2,66 36,05±2,75 39,3±3,15 Оптическая плотность окрашивания, у.е. 0,437±0,03 0,304±0,02** 0,520±0,03 **р<0,01 по сравнению с контрольной группой. рис. 2. Экспрессия аннексина Ki-67 в синцитиотрофобласте (1), строме ворсин (2), эндотелии сосудов ворсин хориона (3) в об- следованных группах: а – основная группа; б – группа сравне- ния; в – контрольная группа. иГх-метод. рис. 3. Экспрессия р53 в синцитиотрофобласте (1) и строме вор- син хориона (2) в обследованных группах: а – основная группа, б – группа сравнения, в – контрольная группа. иГх-метод. рис. 4. Экспрессия mCl-1 в синцитиотрофобласте (1) и в строме ворсин хориона (2) в обследованных группах: а – основная группа; б – группа сравнения; в – контрольная группа. иГх-метод. самопроизвольного выкидыша и неразвивающейся бере- менности на фоне коррекции нарушений гемостаза с I три- местра у беременных с тромбофилией (3,57%) по сравне- нию с группой, не получавшей такую терапию (18,00%), со- гласуются с результатами отечественных и зарубежных ис- следований, показавших ее эффективность [3, 8, 19]. Эти ре- зультаты, возможно, обусловлены как эффектом противо- тромботической терапии на свертывающую систему, так и ее негемостазиологическими эффектами. В ряде работ пока- зана эффективность антитромботических препаратов для предотвращения осложнений беременности [22, 46, 52], вы- сказывается мнение, что антикоагулянты могут оказывать определяющее влияние на развивающийся трофобласт вне зависимости от тромботических механизмов [23, 38]. Аннексин V – кальцийзависимый фосфолипидсвязываю- щий белок, предотвращающий мембранозависимую акти- вацию факторов свертывания материнской крови. Связывание аннексинa V с апикальной поверхностью синци- тиотрофобласта является ключевым моментом для поддер- жания кровотока в плаценте и выживания плода [3]. Вы- явленное нами достоверное снижение площади окрашива- ния синцитиотрофобласта ворсин в группах с невынаши- ванием и тромбофилией по сравнению с контрольной группой может быть следствием комплекса неблагопри- ятных факторов формирования плаценты, включающих в себя и нарушения в системе гемостаза. Данные об оптиче- ской плотности окрашивания, не отличавшейся в конт- рольной и основной группах, могут свидетельствовать о положительном влиянии проведенной терапии, при кото- рой имеет место сохранение протективных свойств син- цитиотрофобласта. Структурную полноценность плаценты также опреде- ляет соотношение клеточной гибели и пролиферации. Бе- лок р53 задействован в реализации механизмов клеточной гибели. В плаценте р53 экспрессируется в цито- и синци- тиотрофобласте, в клетках базальной пластинки [32]. По данным K.Marzusch и соавт., высокая экспрессия р53 на- блюдается во внутренних слоях цитотрофобласта и в ко- лоннах клеток цитотрофобласта, в синцитии экспрессия – несколько ниже [25]. Согласно полученным нами данным, экспрессия маркера апоптоза р53 выявлялась как в синци- тиотрофобласте, так и в строме ворсин во всех исследуе- мых образцах тканей. Изучаемые параметры экспрессии р53 не различались в изучаемых группах. Однако интен- сивность экспрессии ингибитора апоптоза MCL-1 (с уче- том оптической плотности окрашивания) была досто- верно меньше в группе сравнения, нежели в основной и контрольной группах, что говорит о подавлении механиз- мов, сдерживающих программированную клеточную ги- бель в синцитиотрофобласте и строме ворсин в группе бе- ременных, где коррекция нарушений гемостаза не прово- дилась. По данным работы J.Bulmer и соавт. (1988 г.), экспрессия маркера клеточной пролиферации Ki-67 выявлялась в ци- тотрофобласте. При доношенной беременности экспрес- сия данного маркера в цитотрофобласте ворсин и вневор- синчатом трофобласте значительно снижается и отражает угасание пролиферативной активности в этих тканях неза- долго до родов [26]. В нашем исследовании отмечено преобладание площади экспрессии Ki-67 и оптической плотности окрашивания в основной и контрольной группах, что, возможно, указы- вает на менее выраженное подавление пролиферативных процессов в плацентарной ткани в этих группах. По дан- ным K.Widdows и соавт., объем ткани цитотрофобласта и общее количество цитотрофобласта с экспрессией Ki-67 снижаются при ЗВРП [55]. Полученные нами результаты о сниженной пролиферативной активности трофобласта в группе сравнения, возможно, объясняются преобладанием хронический ПН и ЗВРП. таблица 6. Экспрессия сЭФр в плаценте в обследованных группах Экспрессия сЭФр основная группа (n=8) Группа сравнения (n=7) Контрольная группа (n=7) Площадь окрашенных участков, % 17,38±4,87* 1,08±0,46** 36,25±6,88 Оптическая плотность окрашивания, у.е. 0,519±0,06 0,273±0,02** 0,480±0,06 *р<0,05 по сравнению с контрольной группой, **р<0,01 по сравнению с контрольной группой. рис. 5. Экспрессия сЭФр в строме ворсин (1) и в эндотелии сосу- дов ворсин хориона (2) в обследованных группах: а – основная группа, б – группа сравнения, в – контрольная группа. иГх-метод. СЭФР экспрессируется в синцитиотрофобласте и эндо- телии сосудов и капилляров плацентарной ткани. Дефицит СЭФР может привести к дисфункции эндотелия, что может способствовать развитию тяжелого гестоза [54] за счет дис- баланса между проангиогенными и антиангиогенными факторами [47]. Обнаруженные J.Park и соавт. (2010 г.) на- рушения экспрессии генов, вовлеченных в ангиогенез у па- циенток с тяжелым гестозом, говорят о том, что изменения экспрессии гена СЭФР могут быть вовлечены в патогенез развития тяжелого гестоза [53]. По данным нашего исследования, экспрессия СЭФР ил- люстрирует значительно большую распространенность процессов ангиогенеза при физиологической беременно- сти по сравнению с группами с невынашиванием. Пре- обладание площади экспрессии СЭФР в группе беремен- ных с невынашиванием, получавших лечение, направлен- ное на коррекцию нарушений гемостаза, над данным по- казателем в группе сравнения может говорить о положи- тельном влиянии проведенного лечения на процесс ан- гиогенеза в плацентарной ткани, что клинически реализу- ется в улучшении исходов беременности на фоне прове- денной терапии. Клиническая эффективность применения дипиридамола и надропарина уже на раннем сроке беременности под- тверждается снижением числа случаев самопроизвольного прерывания беременности, ЗВРП, увеличением частоты срочных родов. Данные ИГХ-исследования продемонстри- ровали положительное влияние проведенной терапии на процессы ангиогенеза, пролиферации и антикоагулянтной защиты в плаценарной ткани, что позволяет патогенетиче- ски обосновать целесообразность применения дипирида- мола и надропарина у беременных с тромбофилией и не- вынашиванием.
×

References

  1. Аржанова О.Н., Шляхтенко Т.Н., Тышкевич О.В. Комплексная терапия плацентарной недостаточности у беременных с наличием в крови антифосфолипидных антител. Акушерство и гинекология. 2004; 6: 50–1.
  2. Демидова Е.М. Привычный выкидыш (патогенез, акушерская тактика). Автореф. дис. … д - ра мед. наук. М., 1993.
  3. Макацария А.Д., Бицадзе В.О. Тромбофилии и противотромботическая терапия в акушерской практике. М.: Триада-Х, 2003.
  4. Репина М.А. и др. Наследственные нарушения системы гемостаза и беременность: методические рекомендации. Под ред. Э.К.Айламазяна. Спб.: Изд - во Н-Л, 2008.
  5. Матвеева Т.Е., Бицадзе В.О., Баймурадова С.М. и др. Основные принципы ведения беременности у женщин с синдромом потери плода и тромбофилией в анамнезе. Акушерство и гинекология. 2003; 4: 26–30.
  6. Сидельникова В.М., Кирющенков П.А., Ходжаева З.С. и др. Патогенетическое обоснование использования курантила в акушерстве. Акушерство и гинекология. 1999; 5: 52–4.
  7. Савельева Г.М., Федорова М.В., Клименко П.А. и др. Плацентарная недостаточность. М.: Медицина, 1991.
  8. Макацария А.Д. и др. Профилактика повторных осложнений беременности в условиях тромбофилии: руководство для врачей. М.: Триада-Х, 2008.
  9. Радзинский В.Е., Оразмурадов А.А., Милованов А.П. Ранние сроки беременности. М.: МИА, 2005.
  10. Сидельникова В.М. Невынашивание беременности – современный взгляд на проблему. Рос. вестн. акушера - гинеколога. 2007; 2: 62–4.
  11. Сидельникова В.М., Милованов А.П., Кирющенков П.А. и др. Состояние фетоплацентарной системы при использовании курантила в комплексном лечении беременных с аутосенсибилизацией к хорионическому гонадотропину человека. Акушерство и гинекология. 2000; 6: 10–3.
  12. Зайнулина М.С. и др. Тромбофилии в акушерской практике: учебно - методическое пособие. Под ред. Э.К.Айламазяна, Н.Н.Петрищева. Спб.: Изд - во Н-Л, 2005.
  13. Dolitzky M, Inbal A, Segal Y et al. A randomized study of thromboprophylaxis in women with unexplained consecutive recurrent miscarriages. Fertil Steril 2006; 86 (2): 362–6.
  14. Alonso A, Soto I, Urgellos M.F et al. Acquired and inherited thrombophilia in women with unexplained fetal losses. Am J Obstet Gynecol 2002; 187 (5): 1337–42.
  15. Johnny S et al. Activated protein C resistance and factor V Leiden mutation can be associated with first – as well as - second trimester recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol 2000; 43: 31–5.
  16. Gris J.C, Quéré I, Sanmarco M et al. Antiphospholipid and antiprotein syndromes in non - thrombotic, non - autoimmune women with unexplained recurrent primary early foetal loss. Thromb Haemost 2000; 84 (2): 228–36.
  17. Grandone E et al. Antithrombotic prophylaxis during pregnancy in women with deficiency of natural anticoagulants. Blood Coagul Fibrinolysis 2008; 19 (3): 226–30.
  18. Guan L.X, Du X.Y, Wang J.X et al. Association of genetic polymorphisms in plasminogen activator inhibitor-1 gene and 5, 10-methylenetetrahydrofo - late reductase gene with recurrent early spontaneous abortion. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 2005; 22 (3): 330–3.
  19. Brenner B. Enoxaparin treatment improves the gestational outcome of pregnant women with thrombophilia and recurrent pregnancy loss: The LIVE-ENOX Study. Blood 2003; 102.
  20. Brenner B, Kupferminc M.J. Inherited thrombophilia and poor pregnancy outcome. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2003; 17 (3): 427–39.
  21. Deruelle P, Coulon C. The use of low - molecular - weight heparins in pregnancy – how safe are they? Curr Opin Obstet Gynecol 2007; 19 (6): 573–7.
  22. Brenner B, Bar J, Ellis M et al. Effects of enoxaparin on late pregnancy complications and neonatal outcome in women with recurrent pregnancy loss and thrombophilia: results from the Live-Enox study. Fertil Steril 2005; 84 (3): 770–3.
  23. Quenby S, Mountfield S, Cartwright J.E et al. Effects of low molecular - weight and unfractionated heparin on trophoblast function. Obstet Gynecol 2004; 104: 354–61.
  24. Santoro R, Iannaccaro P, Prejan S et al. Efficacy and safety of the long - term administration of low - molecular - weight heparins in pregnancy. Blood Coagul Fibrinolysis 2009; 20 (4): 240–3.
  25. Marzusch K, Ruck P, Horny H.P et al. Expression of the p53 tumour suppressor gene in human placenta: an immunohistochemical study. Placenta 1995; 16 (1): 101–4.
  26. Bulmer J.N, Morrison L, Johnson P.M. Expression of the proliferation markers Ki67 and transferring receptor by human trophoblast populations. J Reprod Immunol 1988; 14 (3): 291–302.
  27. Edstrom C.S, Calhoun D.A, Christensen R.D. Expression of tissue factor pathway inhibitor in human fetal and placental tissues. Early Hum Dev 2000; 59 (2): 77–84.
  28. Rai R et al. Factor V Leiden and acquired activated protein C resistance among 1000 women with recurrent miscarriage. Hum Reprod 2001; 16 (5): 961–5.
  29. Grandone E, Margaglione M, Colaizzo D et al. Factor V Leiden is associated with repeated and recurrent unexplained fetal losses. Thromb Haemost 1997; 77 (5): 822–4.
  30. Greer I.A. Antithrombotic Therapy for Recurrent Miscarriage? N Engl J Med 2010; 362: 1630–1.
  31. F Hills A et al. Heparin prevents programmed cell death in human throphoblast. Mol Hum Reprod 2006; 12 (4): 237–43.
  32. Haidacher S et al. Immunohistochemical evidence of p53 protein in human placenta and choriocarcinoma cell lines. Hum Reprod 1995; 10 (4): 983–8.
  33. Kupferminc M.J et al. Increased frequency of genetic thrombophilia in women with complications of pregnancy. N Engl J Med 1999; 340 (1): 9–13.
  34. Di Simone N et al. Low molecular weight heparin actions on human endometrial angiogenesis. Thromb Research 2011; 127 (Suppl. 3): 125.
  35. Badawy A.M et al. Low - molecular weight heparin in patients with recurrent early miscarriages of unknown aetiology. J Obstet Gynaecol 2008; 28 (3): 280–4.
  36. Sambrook J et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989; p. 1659.
  37. Martinelli I et al. Mutations in coagulation factors in women with unex - plained late fetal loss. N Engl J Med 2000; 343 (14): 1015–8.
  38. Nelson S.M, Greer I.A. The potential role of heparin in assisted conception. Hum Reprod Update 2008; 14 (6): 623–45.
  39. Pabinger I. Thrombophilia and its impact on pregnancy. Thromb Res 2009; 123 (Suppl. 3): 16–21.
  40. Sebire N.J et al. Placental massive perivillous fibrin deposition associated with antiphospholipid antibody syndrome. Br J Obstet Gynaecol 2002; 109 (5): 570–3.
  41. Sebire N.J et al. Placental pathology, antiphospholipid antibodies, and pregnancy outcome in recurrent miscarriage patients. Obstet Gynecol 2003; 101: 258–63.
  42. Dossenbach-Glaninger A et al. Plasminogen Activator Inhibitor 1 4G/5G Polymorphism and Coagulation Factor XIII Val34Leu Polymorphism: Impaired Fibrinolysis and Early Pregnancy Loss. Clinical Chemistry 2003; 49 (7): 1081–6.
  43. Isermann B et al. Platelet activation impairs placental function. Thromb Res 2009; 123 (Suppl. 2): 85–7.
  44. Sato Y et al. Platelet - derived soluble factors induce human extravillous trophoblast migration and differentiation: platelets are a possible regulator of trophoblast infiltration into maternal spiral arteries. Blood 2005; 106 (2): 428–35.
  45. Aarabi M et al. Polymorphisms of plasminogen activator inhibitor-1, angiotensin converting enzyme and coagulation factor XIII genes in patients with recurrent spontaneous abortion. J Matern Fetal Neonatal Med 2010; 24 (3): 545–8.
  46. Rai R et al. Randomised controlled trial of aspirin and aspirin plus heparin in pregnant women with recurrent miscarriage associated with phospholipid antibodies (or antiphospholipid antibodies). BMJ 1997; 314 (7076): 728–36.
  47. Bdolah Y et al. Recent advances in understanding preeclampsia. Croat Med J 2005; 46 (5): 728–36.
  48. Toth B et al. Recurrent miscarriage: current concepts in diagnosis and treatment. J Reprod Immunol 2010; 85 (1): 23–32.
  49. Folkeringa N et al. Reduction of high fetal loss rate by anticoagulant treatment during pregnancy in antithrombin, protein C or protein S deficient women. Haematol 2007; 136 (4): 656–61.
  50. Gris J.C et al. Respective evaluation of the prevalence of haemostasis ab - normalities in unexplained primary early recurrent miscarriages. The Nimes Obstetricians and Haematologists (NOHA) Study. Thromb Haemost 1997; 77 (6): 1096–103.
  51. Sood R. Thrombophilia and fetal loss: Lessons from gene targeting in mice. Thromb Res 2009; 123 (Suppl. 2): 79–84.
  52. Deligiannidis A et al. Thrombophilia and antithrombotic therapy in women with recurrent spontaneous abortions. J Reprod Med 2007; 52 (6): 499–502.
  53. J Park S et al. Vascular endothelial growth factor, fms - like tyrosine kinase-1 (Flt-1) and soluble Flt-1 gene expressions in Korean pre - eclamptic placentas. J Obstet Gynaecol Res 2010; 36 (4): 726–32.
  54. Zhou Q et al. VEGF deficit is involved in endothelium dysfunction in preeclampsia. J Huazhong Univ Sci Technol (Med Sci) 2010; 30 (3): 370–4.
  55. Widdows K. Gestational related morphological abnormalities in placental villous trophoblast turnover in compromised pregnancies. Brunel University, Uxbridge 2004.

Copyright (c) 2013 Kornyushina E.A., Zaynulina M.S., Kostyuchek I.N., Kleschev M.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies