Diagnosis and treatment of vaginal microbiome: Is it all that simple?

Full Text

В настоящее время прослеживается четкая тенденция увеличения числа пациенток с жалобами на количество и качество влагалищных выделений, что доставляет множество физических и психологических неудобств женщинам. Речь идет не только о наличии обильных выделений, дискомфорта во влагалище, но и страха быть отвергнутой половым партнером, риска развития воспалительных заболеваний органов малого таза, патологии беременности и родов. Изменение микробиома половых путей в отсутствие облигатных патогенов проявляется в увеличении количества условно-патогенных микроорганизмов, контаминации несвойственных данному виду бактерий мест обитания и уменьшении количества нормофлоры, прежде всего лактобацилл. Многочисленные исследования последних десятилетий показали - по отдельности ни один из условно-патогенных возбудителей не имеет большого значения в развитии патологического процесса, что противоречит постулатам Коха: 1) микроорганизм должен присутствовать при каждом случае болезни, определяя ее клиническое течение; 2) микроорганизм не встречается при других болезнях как непатогенный паразит; 3) после выделения от больного и пассажа в чистой культуре микроорганизм вновь способен вызвать болезнь. В связи с чем для постановки диагноза и определения тактики лечения пациенткам с нарушенными влагалищными выделениями в отсутствие патогенов следует провести комплексное обследование. Микроскопическое исследование мазка из цервикального канала и отделяемого из влагалища является необходимым методом в скрининге и диагностике инфекционно-воспалительных заболеваний женских половых путей (цервицит, вагинит), поскольку позволяет оценить степень воспалительного процесса (лейкоцитарная реакция) и состояние микрофлоры, а также выявить элементы грибов рода Candida, трихомонады, внутриклеточные диплококки. Кроме того, определяются количество лактобацилл - грамположительных палочек разной длины и толщины; грамвариабельной (смешанной) кокко-бациллярной микрофлоры; наличие ключевых клеток, которые представляют собой поверхностные клетки эпителия влагалища с адгезированными на них бактериями. Для оценки результатов исследования препаратов, полученных из отделяемого влагалища и окрашенных по Граму, используется стандартная 10-балльная шкала (критерии Ньюджента), которая была предложена в 1991 г. R.Nugent. В основе лежит система баллов по оценке трех бактериальных морфотипов влагалища: А - лактобациллы - большие грампозитивные палочки (Lactobacilus acidophilus: large gram-positive rods); B - вагинальная гарднерелла и бактероиды - мелкие грамвариабельные и грамотрицательные кокки (Gardnerella vaginalis и Bacteroides species: small gram-variable or gram-negative rods); C - мобилункус - изогнутые грамвариабельные палочки (Mobiluncus species: curved gram-variable rods). Выделяют состояния: бактериальный вагиноз - БВ (7-10 баллов), нормальная микробиота (0-3 балла), «промежуточная флора» (4-6 баллов). Недостаток метода - ограничения определения морфотипов без возможности видовой характеристики микроорганизмов и только приблизительная оценка количественного состава микробиоты. Микроскопия не позволяет определить роль возбудителей в развитии инфекционного процесса. В клинической практике для идентификации возбудителей с количественной оценкой традиционно применяются культуральные исследования. В последние десятилетия признан факт, что традиционные микробиологические методы не только не в состоянии дать полную качественную и количественную характеристику микробиоценоза влагалища, но и тем более не позволяют анализировать особенности популяционных взаимодействий микроорганизмов. Культуральный метод практически всегда основан на получении и изучении чистой культуры микроорганизмов, что полностью исключает возможность получения представления о микробиоте как о системе. Появление методов амплификации нуклеиновых кислот позволило идентифицировать микроорганизмы, плохо поддающиеся культивированию. Однако следует учитывать, что качественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) не позволяет определить этиологическое значение тех или иных микроорганизмов в развитии дисбиотических нарушений, решить вопрос о необходимости терапии. Достижения молекулярной биологии дают возможность исследования микробиоты методом ПЦР в режиме реального времени. Этим методом можно объективно исследовать количество условно-патогенной и нормальной флоры, степень и характер дисбаланса, а также провести контроль эффективности лечения. Метод ПЦР в реальном времени включает одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце, проведение анализа микробного сообщества без разделения его на отдельные компоненты. Количественная оценка вагинального биотопа позволяет избежать неэффективного лечения и вовремя назначить специфическое лечение. При обсуждении выбора терапии хотелось бы отметить важное обстоятельство - отделяемое влагалища в норме содержит 108-1012 КОЕ/мл микроорганизмов, при этом факультативно-анаэробные бактерии составляют 103-105 КОЕ/мл, анаэробные - 105-109 КОЕ/мл, но ведущее место занимают микроаэрофильные лактобактерии, количество которых может достигать 109 КОЕ/мл. Колонизируя слизистую влагалища, лактобактерии участвуют в формировании экологического барьера и обеспечивают тем самым резистентность вагинального биотопа. Защитные свойства лактобактерий реализуются по-разному: за счет антагонистической активности, способности продуцировать лизоцим, перекись водорода и адгезивных свойств. Однако основным механизмом, обеспечивающим колонизационную резистентность вагинального биотопа, является способность лактобактерий к кислотообразованию. В то же время некоторые лактобациллы не производят перекись водорода или бактериоцины, которые способствуют защите влагалища от чрезмерного роста патогенных микроорганизмов, и, занимая основной пул, могут спровоцировать, а не предотвратить болезнь. Не вызывает сомнений, что необходимы внедрение современных методов диагностики, совершенствование лечения и профилактики нарушений микробиоценоза влагалища. Изученные свойства лактобацилл могут быть использованы для применения препаратов с целью стабилизации нормофлоры генитального тракта. С указанных позиций представляет интерес швейцарский эубиотик Гинофлор Э, основой которого являются лиофилизат L. acidophilus 50 мг (по меньшей мере 100 млн жизнеспособных бактерий) и эстриол 0,03 мг. Высокие дозы жизнеспособных бактерий Lactobacillі помогают восполнить естественную флору влагалища. В лабораторных условиях доказана способность лактобактерий, входящих в состав Гинофлора Э, быстро размножаться в благоприятной среде, снижать рН и вырабатывать перекись водорода. Эстриол в ультранизкой дозе обеспечивает восстановление вагинального эпителия, насыщение его гликогеном при этом в системном кровотоке не определяется. Лактоза, входящая в состав вагинальных таблеток, может быть быстро ферментирована бактериями Lactobacillі в молочную кислоту. Цель исследования Повышение эффективности терапии нарушений микробиома влагалища посредством локального применения Гинофлора Э. Материалы и методы Под наблюдением находились 120 женщин сексуально активного репродуктивного возраста (18-45 лет) с жалобами на дискомфорт во влагалище и выделения. Критерии включения: 1. Женщины в возрасте от 18 до 45 лет. 2. Жалобы на зуд, жжение во влагалище, выделения. 3. Отсутствие беременности. 4. Пациентки, соблюдающие указания врача. 5. Согласие на использование барьерных методов контрацепции. Критерии исключения: 1. Беременность и лактация. 2. Эндометриоз. 3. Наличие инфекций, передаваемых половым путем. Лабораторные исследования 1. Микроскопическое исследование мазка, окрашенного по Граму, с оценкой по шкале Ньюджента из цервикального канала и влагалища - оценивали лейкоцитарную реакцию, состояние микрофлоры. 2. pH-метрия влагалищного отделяемого. Значение рН измеряли непосредственно во влагалищных выделениях или на зеркале. Для определения уровня pH вагинального секрета использовали универсальные индикаторные полоски с эталонной шкалой. 3. Тест с 10% КОН (аминный тест). Для выявления летучих аминов, «рыбного» запаха каплю вагинального отделяемого помещали на предметное стекло, затем добавляли каплю 10% раствора KOH, немедленно оценивали появляющийся при этом запах или его отсутствие. 4. Генодиагностическое исследование: а) ПЦР - качественное определение. б) ПЦР - количественное исследование при помощи тест-системы «АмплиСенс Флороценоз» ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, основанной на проведении ПЦР в реальном времени (сравнение содержания конкретных представителей нормо- и условно-патогенной биоты с общей бактериальной массой - ОБМ). Оценивались качество взятия соскоба и адекватность результата исследования с помощью специального параметра - контроля взятия материала, сравнивалось количество лактобактерий с ОБМ; условных патогенов в ОБМ; изучались нормофлора (Lactobacillus spp.), аэробные (Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp.), облигатно-анаэробные микроорганизмы (G. vaginalis/Atopobium vaginae). Установление клинико-микробиологических критериев излеченности проводилось через 30 дней после окончания терапии. На протяжении исследования совершалось три визита, включающих: осмотр слизистых гениталий до терапии и в последний день лечения, далее через 30 дней с лабораторным контролем. На основании анализа результатов лабораторной диагностики больные были разделены на 4 группы по 30 человек: · 1-я группа - пациентки с БВ; · 2-я группа - с аэробным вагинитом; · 3-я группа - женщины с сочетанием БВ и урогенитального кандидоза; · 4-я группа - пациентки после антибактериальной терапии. В 1-3-й группах по 15 женщин получали стандартную терапию и Гинофлор Э, лечение проводили в два этапа: на первом назначалась антибактериальная терапия; на втором - Гинофлор Э; по 15 больных (подгруппы сравнения) - только стандартная терапия, в 4-й группе - только Гинофлор Э. Лечение БВ, аэробного вагинита, урогенитального кандидоза проводили в соответствии с Российскими и международными рекомендациями (Российское общество дерматовенерологов и косметологов, Centers for Diasease Control and Preventation, Европейские рекомендации). Гинофлор Э применялся по 1 вагинальной таблетке на ночь №12 на курс. Критерии оценки эффективности Клиническая эффективность - исчезновение жалоб и клинических проявлений. Лабораторная эффективность - нормализация данных микроскопии и флороценоза. Результаты У всех женщин, принявших участие в исследовании, были жалобы на выделения, дискомфорт во влагалище. Высокие значения рН наблюдались у 72 пациенток (рН 5,5±0,5), повышенные (рН 5,0±0,5) - у 48, нормальных значений (рН 3,8-4,2) не зарегистрировано ни в одном случае. Интересно, что у всех женщин выявлялись лактобациллы, но у большинства лактобациллы уступали доминирующее положение облигатно-анаэробным или аэробным бактериям. У 15 пациенток по критериям R.Nugent отмечался нормоценоз, количество лактофлоры оценивалось более 30, тогда как в отсутствие лейкоцитарной реакции, эритроцитов регистрировалось повышение рН до 5,0±0,5. Положительный аминный тест отмечался у 90 женщин. Поскольку различные виды нарушений микробиоты требуют совершенно разных подходов терапии, чрезвычайно важны определение состава ассоциантов и их количество. Так, лечение метронидазолом, препаратом выбора для БВ, будет малоэффективным при наличии A. vaginae или аэробного вагинита. Известно, что у женщин с относительным нормоценозом могут преобладать Lactobacillus iners, имеющие более слабый защитный потенциал, перекисьобразующие свойства. При осмотре в зеркалах женщин 1-й группы регистрировались обильные или умеренные сливкообразные гомогенные выделения, реже - скудные кремообразные, слизистая влагалища без признаков воспаления, отсутствие лейкоцитарной реакции. Нарушение микробиоты влагалища сопровождалось повышением рН до 5,0±0,5; положительным аминным тестом, усилением роста анаэробных условно-патогенных бактерий, главным образом G. vaginalis, A. vaginae и снижением количества Lactobacillus spp. В 1-й группе, подгруппа 1в (сравнение), 15 человек применяли стандартное лечение клиндамицином по 300 мг 2 раза в сутки в течение 7 дней, 15 больных в подгруппе 1а (основная) - лечение клиндамицином по 300 мг 2 раза в сутки в течение 7 дней с последующим использованием Гинофлора Э по 1 свече на ночь, №12. Сохранение G. vaginalis и A. vaginae в титре, равном количеству Lactobacillus spp. при исследовании через месяц после двухэтапного лечения, отмечалось только у 3 (20%) больных. У остальных 12 пациенток наблюдалось как клиническое, так и лабораторное излечение. Эффективность метода составила 80%. Обратимся теперь к результатам, полученным после стандартного лечения. Неудовлетворительный ответ (сохранение G. vaginalis и A. vaginae в титре, превышающем количество Lactobacillus spp. через месяц после окончания лечения) отмечался у 7 (46,66%) больных, у 8 пациенток G. vaginalis и A. vaginae не выявлялись. Эффективность метода составила лишь 53,33%. При терапии БВ клиндамицином имело место резкое угнетение Lactobacillus spp., что является одной из причин роста условно-патогенных микроорганизмов и нового рецидива заболевания. Значение молекулярно-генетического исследования в режиме реального времени в современной медицинской практике возрастает еще больше благодаря возможности определения конкретных возбудителей, участвующих в воспалительном процессе. Так, пациентки, вошедшие во 2-ю группу, неоднократно получали антибактериальную терапию системно и местно по поводу «анаэробного вагинита» на основании качественного определения ДНК G. vaginalis, A. vaginae. После повторных курсов метронидазола и клиндамицина жалобы на жжение и дискомфорт во влагалище сохранялись. При осмотре в зеркалах отмечались гиперемия преддверия и стенок влагалища, шейки матки, умеренные или скудные слизисто-гнойные выделения. У всех больных рН влагалища был высоким - 6,0±0,5, аминный тест - отрицательный. С помощью ПЦР-диагностики определены усиление роста аэробных условно-патогенных бактерий, главным образом Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., и снижение количества Lactobacillus spp., тогда как ДНК G. vaginalis, A. vaginae определялась в клинически незначимом титре, что подтверждалось отрицательным аминным тестом. Во 2-й группе 15 женщин подгруппы 2в (сравнение) получали терапию амоксициллин/клавунат 875/125 мг 2 раза в сутки в течение 7 дней, а 15 человек подгруппы 2а (основная) лечение амоксициллин/клавунат 875/125 мг 2 раза в сутки в течение 7 дней с последующим использованием Гинофлора Э по 1 свече на ночь, №12. У 13 пациенток на фоне нормализации количества Lactobacillus spp. наблюдалось как клиническое, так и лабораторное излечение. Эффективность метода при исследовании через месяц после двухэтапного лечения составила 86,87%. Обратимся теперь к результатам, полученным после монотерапии. Неудовлетворительный ответ (сохранение Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp. в титре, превышающем количество Lactobacillus spp. через месяц после окончания лечения) отмечался у 5 (33,33%) больных, у больных в титре 6 (40%) - меньше количества Lactobacillus spp., у 4 (26,66%) пациенток Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp. не выявлялись. Количество Lactobacillus spp. нормализовалось у 10 человек. Эффективность метода составила 66,66%. В развитии урогенитального кандидоза большое значение имеет как состояние микробиоты влагалища, так и макроорганизма в целом, изменение которых под воздействием ряда провоцирующих факторов может приводить к возникновению кандидоза, даже при сдвиге рН в щелочную сторону. При осмотре в зеркалах у большинства женщин 3-й группы отмечались умеренная гиперемия преддверия и стенок влагалища, шейки матки, реже - ее отсутствие. Клинические признаки БВ и урогенитального кандидоза в «классическом варианте» при сочетанном течении инфекции отсутствовали и включали обильные желто-зеленые или серо-зеленые творожистые и сливкообразные выделения. Нарушение микробиоты влагалища сопровождалось повышением рН до 5,5±0,5; положительным аминным тестом, усилением роста анаэробных условно-патогенных бактерий, главным образом G. vaginalis, A. vaginae. С помощью «АмплиСенс Флороценоз» существует возможность количественной детекции ДНК не только широко распространенной Candida albicans, но и приобретающих все большее клиническое значение других видов Candida krusei, Сandida glabrata, Candida tropicalis. Определены усиление роста C. albicans, реже - C. krusei, значительно реже - С. glabrata, C. tropicalis и снижение количества Lactobacillus spp. В 3-й группе, подгруппа 3в (сравнение), 15 человек получали терапию флуконазолом 150 мг однократно и клиндамицин кремом 2% 5,0 г в аппликаторе (разовая доза) интравагинально 1 раз в сутки (на ночь) в течение 7 дней, в подгруппе 3а (основная) 15 человек наряду с флуконазолом 150 мг однократно и клиндамицин крем 2% 5,0 г в аппликаторе (разовая доза) интравагинально 1 раз в сутки (на ночь) в течение 7 дней использовали Гинофлор Э по 1 свече на ночь, №12. У 11 пациенток наблюдалось как клиническое, так и лабораторное излечение: количество Lactobacillus spp. нормализовалось. Эффективность метода составила 73,33%. Обратимся теперь к результатам, полученным после стандартного лечения. Неудовлетворительный ответ (сохранение G. vaginalis и A. vaginae в титре, превышающем количество Lactobacillus spp. через месяц после окончания лечения) отмечался у 7 (46,66%) больных, детекция G. vaginalis и A. vaginae в титре меньшего количества Lactobacillus spp. - у 4 (26,66%), у 4 (26,66%) пациенток G. vaginalis и A. vaginae не выявлялись. Количество Lactobacillus spp. через месяц после проведенной терапии нормализовалось у 7 (46,66%) человек. Эффективность метода составила лишь 46,66%. При терапии БВ клиндамицином в форме вагинального крема имело место угнетение Lactobacillus spp. у 7 пациентов, что явилось одной из причин роста условно-патогенных микроорганизмов и нового рецидива заболевания. В 4-ю группу вошли пациентки, проходящие антибактериальную терапию за 30 дней до исследования. На фоне жалоб на выделения и дискомфорт при осмотре в зеркалах отмечались умеренная гиперемия слизистой преддверия влагалища и шейки матки. Скудные слизистые или гомогенные выделения. Отсутствие лейкоцитарной реакции. Повышенный рН от 4,5 до 4,7, отрицательный аминный тест. С помощью метода ПЦР-диагностики определено сниженное количество ОБМ у 25 женщин, Lactobacillus spp. ниже нормальных значений у 21 больной. Все 30 пациенток использовали Гинофлор Э по 1 свече на ночь, №12. После лечения титр Lactobacillus spp. не достиг нормы у 4 (13,33%) больных, количество Lactobacillus spp. нормализовалось у 26 человек. Эффективность метода составила 86,66%. Таким образом, включение Гинофлор Э в стандартные методы терапии нарушений микробиома нижних отделов генитального тракта способствовало значимому повышению эффективности лечения до 86% вместо 46-53% при использовании только антибактериальной терапии. Препарат хорошо переносится больными, побочных эффектов и аллергических реакций зарегистрировано не было. Таким образом, 12-дневное применение Гинофлора Э позволяет быстро заселить влагалище лактобактериями, что обеспечивает восстановление физиологического микробиома влагалища. На основании результатов полученного исследования Гинофлор Э может рекомендоваться в комплексной терапии БВ, аэробного вагинита и сочетанных инфекций генитального тракта.

About the authors

N I Chernova

Email: d.chernova@mail.ru

Yu N Perlamutrov

Email: d.chernova@mail.ru

I S Petrova

Email: d.chernova@mail.ru

Supplementary files