Genetic predictors of outcomes of assisted reproductive technology

Full Text

С огласно определению Всемирной организации здравоохранения, бесплодие - неспособность к за- чатию спустя 12 мес регулярной половой жизни без контрацепции [1]. Примерно у 10% супружеских пар суще- ствуют проблемы с наступлением беременности естествен- ным путем, более 80 млн пар по всему миру страдают бес- плодием и прибегают к лечению методом вспомогатель- ных репродуктивных технологий (ВРТ) [2]. Наиболее ус- пешной и часто используемой методикой ВРТ является экс- тракорпоральное оплодотворение (ЭКО), сложный и мно- гоэтапный процесс, каждый шаг которого имеет решаю- щее значение для успешного исхода программы в целом [3]. Одним из таких этапов является стимуляция суперовуля- ции, главная цель которой состоит в получении оптималь- ного количества зрелых ооцитов, что позволило бы вы- брать наиболее качественный эмбрион для переноса в по- лость матки [4]. В среднем аспирация 8-10 ооцитов (по по- следним публикациям - до 15) рассматривается как наибо- лее успешный результат стимуляции функции яичников [5]. Тем не менее овариальный ответ (ОО) широко варьирует среди пациенток, находящихся в программе ЭКО [6]. При- мерно в 9-24% случаев ОО гораздо ниже ожидаемого [6], с другой стороны, непредвиденное развитие гиперответа яичников может привести к такому серьезному осложне- нию, как синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ) [3]. Та- ким образом, прогнозирование ОО с целью персонализации терапии представляет большой клинический интерес. Предложены различные прогностические маркеры исходов стимуляции функции яичников, такие как: возраст, овариальный резерв, гормональный статус, курение и др. Кроме того, генетическая изменчивость также представ- ляется важным фактором. Хорошо известно о существую- щей индивидуальной вариабельности ответа на терапию разными лекарственными препаратами [7]. Применение знаний фармакогенетики к ОО может помочь не только прогнозировать успех стимуляции суперовуляции [8], но и скорректировать дозы вводимых препаратов с целью инди- видуализации лечения. В геноме человека идентифицированы более 10 млн од- нонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide poly- morphism, SNP) [9]. Влияние полиморфизмов генов на ис- ходы стимуляции функции яичников в программе ЭКО анализировалось многими группами исследователей, но фармакогенетический подход в отношении дозирования препаратов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) не до конца разработан. Большинство исследований сосредо- точены на полиморфизме гена рецептора ФСГ (FSHR) [10], влиянии изменчивости разных биохимических путей, уча- ствующих в синтезе эстрогенов (гены эстрогеновых рецеп- торов - ESR), фолликулогенезе и некоторых других марке- рах (см. таблицу) [10]. Полиморфизм гена FSHR ФСГ является ключевым гормоном в репродукции человека. ФСГ и его рецептор (FSHR) играют важную роль в фолликуло- и стероидогенезе [24]. Ген FSHR локализуется на участке хромосомы 2p21 и состоит из 10 экзонов [18]. В гене FSHR идентифицировано почти 1 тыс. SNP. Два поли- морфизма, расположенные в кодонах 307 [rs6165] и 680 [rs6166], ассоциированы с ОО; rs6165 приводит к амино- кислотной замене Thr307Ala (треонин - Т может быть за- мещен аланином - А в положении 307) во внеклеточном домене белка (гормонсвязывающей области), а rs6166 - к аминокислотной замене Asn680Ser во внутриклеточном (серин - S на аспарагин - N в позиции 680) [18]. Эти поли- морфизмы в основном исследуются с целью оценки реак- ции рецепторов на стимуляцию препаратами ФСГ. Хотя и есть некоторые несоответствия [14], существует доста- точно доказательств того, что полиморфизм N680S спосо- бен прогнозировать ОО на стимуляцию препаратами ФСГ у Ассоциация полиморфизма генов с исходами программ ВРТ Ген Локализация на хромосоме Номер rs Замена белка или кодирую- щей последовательности Основные гипотезы проведенных исследований по изучению ассоциации полиморфизма генов с исходами программ ВРТ FSHR 2p21 rs6166 N680S При носительстве аллеля 680S требуются более высокие дозы препарата ФСГ при стимуляции суперовуляции [11-14] rs1394205 -29G/A Женщины с генотипом -29А/А нуждаются в более высоких дозах препарата ФСГ, у них отмечен более низкий уровень эстрадиола, они продуцируют меньшее число фолликулов и ооцитов [15, 16] LHB 11p13 rs1800447 W8R Женщинам с генотипом W8R [rs1800447] и I15T [rs3439826] требуется введение повышенных доз препарата ФСГ; отмечается аспирация малого количества ооцитов [17, 18] rs3439826 I15T LHCGR 2p21 rs4073366 28G>C Носительство аллеля С ассоциировано с трехкратным повышением риска СГЯ [13, 18, 19] ESR1 6q25 rs2234693 -397T>C У носителей генотипа C/C отмечается получение большего количества фолликулов, зрелых ооцитов, эмбрионов хорошего качества [20, 21] rs9340799 -351A>G У носителей генотипа G/G выше шанс получения большего числа ооцитов и оплодотворения [20, 21] rs3138774 (TA)n Длинные повторы (ТА) ассоциированы с лучшими исходами стимуляции суперовуляции [20, 21] AMГ 19p13 rs10407022 I49S Носители аллелей АМГ 49Ser и AMHR2 -482G имеют повышенную чувствительность к препаратам ФСГ [21-23] AMHR2 12q13 rs2002555 -482A>G Примечание. LHB - ген лютеинизирующего гормона. пациентов, находящихся в программе ЭКО [11, 25, 26]. Так, чтобы достичь сравнимого (одинакового) пикового уровня эстрадиола, дозы препарата ФСГ, назначаемого при стиму- ляции суперовуляции, ниже у женщин с генотипом N/N в позиции 680 по сравнению с женщинами - носителями ал- леля 680S. Таким образом, при наличии аллеля 680S от- мечены снижение чувствительности к гонадотропинам, предрасположенность к «бедному» ОО (БОО) [3]. Уровень эстрадиола, определяемый на момент введения хориони- ческого гонадотропина человека (ХГЧ) у пациенток с гено- типом S/S, статистически значимо ниже по сравнению с пациентками с генотипами N/S и N/N. Интересно, что в ходе исследования, выполненного на контрольной группе доноров ооцитов, были получены аналогичные данные [13]. В проведенном Y.Yao и соавт. метаанализе необходи- мость увеличения вводимых доз гонадотропинов пациент- кам с генотипом S/S объясняется изначально более высо- ким уровнем базального ФСГ [26]. Другие исследования, проведенные на разных популяциях, подтвердили этот вы- вод [12, 27]. Генотип N/N, в свою очередь, ассоциирован с риском развития СГЯ [3]. Таким образом, ген FSHR является важным фактором, спо- собным прогнозировать исход стимуляции функции яич- ников, и может дополнить арсенал имеющихся маркеров. Полиморфизм гена лютеинизирующего гормона Лютеинизирующий гормон (ЛГ) - пептидный гормон, секретируемый гонадотропными клетками передней доли гипофиза. Совместно с другим гипофизарным гонадотро- пином, например ФСГ, ЛГ необходим для нормальной ра- боты репродуктивной системы. ЛГ стимулирует выработку андрогенов, выступающих в роли субстрата для синтеза эстрогенов фолликулами [10]. ЛГ является сложным белком - гетеродимерным глико- протеином. По строению он похож на другие гормоны-гли- копротеины - ФСГ, тиреотропный гормон, ХГЧ. ЛГ имеет димерную структуру и состоит из 2 субъединиц - α и β. β-Субъединица ЛГ, которая и определяет биологическое действие гормона, взаимодействует с мембранным рецеп- тором, представлена 121 аминокислотой [28]. Различная структура олигосахаридных фрагментов влияет на биоло- гическую активность и скорость разрушения гормонов [10]. Ген, кодирующий α-субъединицу, локализован на длин- ном плече хромосомы 6 (6q12.21) [10]. Ген, кодирующий β-субъединицу, локализован на коротком плече хромо- сомы 11 (11р13) и содержит 3 экзона [10, 28]. В данном гене описано 179 SNP [10]. Было обнаружено 3 функционально значимых полиморфизма в кодирующей области гена, приводящих к снижению активности ЛГ [10]. Замены трип- тофан-аргинин в позиции 8 (Trp8Arg) [rs1800447] и изолейцин-треонин в позиции 15 (Ile15Thr) [rs3439826] свя- заны со снижением фертильности [29], бесплодием, ассо- циированным с нарушением менструального цикла [10]. Среди пациенток, обратившихся для проведения про- граммы ЭКО, гаплотип 8Arg-15Thr чаще встречался в группе со сниженным ОО на стимуляцию суперовуляции препаратами рекомбинантного ФСГ (рФСГ) или вовсе ре- зистентных даже к высоким дозам препаратов, соответ- ственно, у таких пациенток получали малое количество ооцитов [17]. Авторы сделали вывод, что таким пациенткам целесооб- разно проводить стимуляцию суперовуляции комбиниро- ванными ЛГ-содержащими препаратами, такой подход улучшает исход программ ВРТ и снижает потребность в вы- соких дозах рФСГ [10]. Полиморфизм гена рецептора ЛГ Рецептор ЛГ (LHR) является G-белком. Он экспрессируется во многих тканях, включая гонады, матку, фаллопиевы трубы, плаценту [30, 31]. LHR находится на поверхности клеток и путем связывания с лигандами способствует со- зреванию фолликулов и овуляции. Ген локализован на участке хромосомы 2p21, состоит из 11 экзонов. LHR также известен как LHCGR (Luteinizing hormone/choriogo- nadotropin receptor - рецептор ЛГ/ХГЧ), так как ЛГ и ХГЧ связываются с одними и теми же рецепторами (ЛГ и ХГЧ - эндогенные лиганды для рецептора ЛГ) [10, 32]. LHCGR со- держит не менее 300 полиморфизмов, некоторые из кото- рых оказывают существенное влияние на половое развитие и фертильность [18]. Так, недавно изученный полиморфизм 28G>C [rs4073366] потенциально способен оказывать влия- ние на процессинг матричной РНК LHCGR [19]. Носитель- ство аллеля С данного генотипа ассоциировано с трехкрат- ным увеличением риска развития СГЯ [33]. Это интересное открытие, безусловно, требует дальнейших исследований на других популяциях. Полиморфизм генов ESR При стимуляции суперовуляции эндогенно продуцируемые эстрогены пролонгируют воздействие препаратов ФСГ на фолликулогенез. Кроме того, эстрогены играют важную роль и в подготовке эндометрия. Эстрогеновые сигналы опосредованы рецепторами, которые в свою оче- редь кодируются генами ESR1 (локализуется на хромосоме 6q25) и ESR2 (локализуется на хромосоме 14q22). Первый фармакогенетический подход, примененный в программе ЭКО, был сфокусирован на полиморфизме гена ESR1 [3]. Наиболее изучены полиморфизмы гена ESR1 -397T>C [rs2234693] и -351A>G [rs9340799] в интроне 1, повторы (TA)n [rs3138774] в промоторной области. У пациентов с ге- нотипом С/С полиморфизма гена ESR1 -397T>C отмечается большее число фолликулов, зрелых ооцитов, эмбрионов хорошего качества [20, 21]. Что касается пациентов с гено- типом G/G полиморфизма гена ESR1 -351 A>G, то они так же, как и пациенты, несущие в генотипе длинные повторы (ТА), предрасположены к более благоприятным исходам стимуляции суперовуляции, высокому ОО, получению большего количества зрелых ооцитов [20, 21]. При изучении одиночного влияния полиморфизма гена ESR2 1730G>А [rs49866938] на ОО статистически значимых результатов получено не было [20]. Однако другие исследо- вания [4, 34] подтверждают гипотезу, что мультигенные мо- дели, в том числе с ESR2 и другими генами, ассоциированы с исходами стимуляции суперовуляции. Полиморфизм гена антимюллерова гормона и его рецептора Концентрация антимюллерова гормона (АМГ) в сыво- ротке крови все чаще используется как один из предикто- ров овариального резерва и ответа на стимуляцию супер- овуляции [35]. АМГ оказывает свое влияние посредством ре- цептора типа 2 (AMHR2). Гены, кодирующие AMГ и AMHR2, локализуются на хромосомах 19p13 и 12q13 соответ- ственно. Изменчивость гена AMН представляет собой инте- рес и описана в работах M.Kevenaar и соавт. [36]. В исследо- вание, в которое были включены нормогонадотропные па- циентки, полиморфизм AMН 146G>T (I49S) [rs10407022] и AMHR2 -482A>G [rs2002555] ассоциирован с повышенными концентрациями эстрадиола, что косвенно может свиде- тельствовать о высокой чувствительности к ФСГ. В литера- туре наблюдается некоторое несоответствие данных о взаимосвязи полиморфизмов с типом ОО, что требует дальнейших исследований. На базе отделения вспомогательных технологий в лече- нии бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова» Минздрава России проведено проспективное исследова- ние, целью которого явился анализ особенностей фоллику- логенеза, оогенеза, эмбриогенеза в программах ВРТ в зави- симости от полиморфизма генов AMН 146G>T (Ile49Ser) [rs10407022]; AMHR2 (-482A>G) [rs2002555]; ESR1 -397T>C [PvuII] [rs2234693]; ESR1 -351A>G [XBaI] [rs9340799]; FSHR 2039G>A (Ser680Asn) [rs6166]; LHCGR 935A>G (Asn312Ser) [rs2293275]; VEGFA -634G>C [rs2010963]; ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938]; LHCGR 872A>G (Asn291Ser) [rs12470652]; SER- PINE1 (PAI-1) -675(5G>4G) [rs1799889]. В исследование включены 160 пациенток, разделенных на 3 группы в зависимости от типа ОО на стимуляцию су- перовуляции: основная группа (80 пациенток с нормаль- ным ОО - 4-10 фолликулов), 1-я группа сравнения (40 па- циенток с БОО - менее 3 фолликулов, согласно Европей- скому обществу репродукции человека и эмбриологии - ESHRE, 2011) [37], 2-я группа сравнения (40 пациенток с ги- перответом яичников - более 10 фолликулов, согласно Американскому обществу репродуктивной медицины, 2008) [38, 39]. Все пациентки соответствовали критериям включения (возраст 18-36 лет, женское бесплодие труб- ного происхождения, мужской фактор бесплодия при от- сутствии выраженной патозооспермии, регулярный мен- струальный цикл) и исключения (эндокринный фактор бесплодия, перенесенные оперативные вмешательства на яичниках, эндометриоз, генетические аномалии, пороки развития половых органов и др.). При проведении анализа анамнестических данных, росто-весовых показателей па- циенток с разным типом ОО различий выявлено не было. По типу и этиологии бесплодия группы пациенток были сравнимы между собой. При проведении анализа получен- ных данных выявлены некоторые факторы, учтенные как конфаундеры (во 2-й группе сравнения преобладали паци- ентки моложе 30 лет, отмечалось удлинение менструаль- ного цикла и увеличение продолжительности менструа- ции, в плазме крови уровень ФСГ был ниже, а АМГ - выше по сравнению с пациентками с нормальным ОО и БОО). Стимуляция суперовуляции проводилась по «короткому» протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гор- мона со 2-3-го дня менструального цикла с использова- нием препаратов рФСГ. Эмбрионы классифицировались по морфологическим критериям в соответствии с классификацией, принятой Istanbul consensus workshop on embryo as- sessment (ESHRE, 2011), - «модифицированной» классифи- кацией D.Gardner [40]. Полиморфизм генов определялся ме- тодом полимеразной цепной реакции с анализом кривых плавления модифицированным методом «примыкающих проб» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Исследование было одобрено комитетом по этике ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова». Статистическая обработка данных выпол- нена с помощью пакета прикладных программ SPSS Statistics 17.0. В качестве меры центральной тенденции количествен- ных признаков была выбрана медиана (Me), а в качестве ин- тервальной оценки - верхний (H) и нижний квартили (L). Результаты представлены в виде Me (L-H). Для оценки значи- мости межгрупповых различий нескольких независимых выборок использовали тест Крускала-Уоллиса. В случае двух выборок применялся U-критерий Манна-Уитни для несвязанных совокупностей. Оценку соответствия выявлен- ных частот генотипов по закону Харди-Вайнберга прово- дили по критерию χ2 в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения. Достоверность различий в частоте встречаемости качественных признаков определяли по критерию χ2. Статистически значимыми счи- тались различия при р<0,05. Отношение шансов (ОШ) при- ведено с 95% доверительным интервалом (ДИ). При анализе ассоциации полиморфизмов исследуемых генов с типом ОО установлено, что наличие генотипа G/G полиморфизма гена FSHR 2039G>A (Ser680Asn) предраспо- лагает к гиперответу [χ2 с поправкой Бонферрони, р=0,021; ОШ 3,49 (95% ДИ 1,3-11,6)]. При анализе распределения частоты генотипов иссле- дуемых генов в зависимости от степени зрелости ооцитов выявлена статистически значимая ассоциация генотипа G/G полиморфизма гена LHCGR935 A>G (Asn312Ser) [ОШ 3,41 (95% ДИ 1,05-11,1), р=0,039]; генотипа С/С полиморфизма гена VEGFA -634G>C [(ОШ 4,09 (95% ДИ 1,3-11,71), р=0,040], генотипа А/А полиморфизма гена AMHR2 -482 A>G [ОШ 2,23 (95% ДИ 1,1-4,3), р=0,025)] c получением только незрелых ооцитов. При анализе ассоциации генотипа пациенток с каче- ством получаемых эмбрионов установлено, что согласно аутосомно-доминантной модели носительство аллеля G полиморфизма гена ESR1 -351A>G [XBaI] более чем в 2 раза повышает риск получения эмбрионов низкого качества класса С [ОШ 2,3 (95% ДИ 1,1-4,6), р=0,022]. Таким образом, геном-ассоциированные исследования, направленные на выявление генетических факторов, пред- располагающих не только к тому или иному типу ОО, но и исходам программы ВРТ в целом, являются весьма актуаль- ными. Поиск новых биомаркеров в данной области про- должается. Разработка панели лабораторных тестов, анали- зирующих мультилокусное взаимодействие разных генов между собой, в перспективе позволит повысить диагности- ческую и практическую значимость полиморфизмов и даст возможность спрогнозировать исходы программ ВРТ.

About the authors

I V Vladimirova

Email: i_teterina@oparina4.ru

E A Kalinina

A E Donnikov

Email: a_donnikov@oparina4.ru

References

Supplementary files