Uterine microbiome in women with uterine scar defect after cesarean section: Prospective cohort study

Anna A. Michelson; Михельсон Анна Алексеевна; Margarita I. Telyakova; Телякова Маргарита Ивановна; Maria V. Lazukina; Лазукина Мария Валерьевна; Guzel N. Chistyakova; Чистякова Гузель Нуховна; Aleksandr V. Ustyuzhanin; Устюжанин Александр Владимирович; Anatoly N. Varaksin; Вараксин Анaтoлий Никoлaeвич; Tatyana A. Maslakova; Маслакова Татьяна Анaтoльевна; Ekaterina D. Konstantinova; Константинова Екатерина Даниловна

doi:10.26442/20795696.2023.3.202353

Uterine microbiome in women with uterine scar defect after cesarean section: Prospective cohort study

Authors: Michelson A.A.¹, Telyakova M.I.¹, Lazukina M.V.¹, Chistyakova G.N.¹, Ustyuzhanin A.V.¹, Varaksin A.N.², Maslakova T.A.², Konstantinova E.D.²
Affiliations:
1. Urals Scientific Research Institute for Maternal and Child Care
2. Institute of Industrial Ecology
Issue: Vol 25, No 3 (2023)
Pages: 348-352
Section: ORIGINAL ARTICLE
URL: https://gynecology.orscience.ru/2079-5831/article/view/546152
DOI: https://doi.org/10.26442/20795696.2023.3.202353
ID: 546152

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. To evaluate the endometrial microbiota in patients with uterine scar defect after cesarean section.

Materials and methods. The study included 80 women of reproductive age. The main group included 50 patients with a uterus scar defect due to cesarean section; the comparison group included 30 women with a competent uterus scar due to cesarean section. Patients underwent a Pipelle endometrial biopsy on days 20–22 of the menstrual cycle using a double-lumen catheter that excludes sample contamination with vaginal and cervical microflora. A molecular genetic study of the endometrium was performed by real-time polymerase chain reaction using the Femoflor 16 reagent kit (DNA-Technology

Moscow). The DNA content in the specimen was measured using software and expressed in genome equivalent (GE) proportional to the number of microorganisms. The statistical data were processed using the Exсel software package and SPSS Statistics 22.0.

Results. The study showed the following statistically significant differences: lower count of Lactobacillus spp. – 2.600 (1.430–3.600) GE/mL vs 3.550 (2.800–4.700) GE/mL in patients of the comparison group (p=0.02); higher count of Streptococcus and Staphylococcus spp. – 3.270 (3.000–3.700) GE/mL and 3.450 (3.200–3.600) GE/mL vs 1.030 (0.760–1.700) GE/mL and 0.560 (0.120–1.200) GE/mL in the comparison group, respectively (p<0.00001); higher count of Enterobacteriaceae – 2.700 (1.700–3.300) GE/mL vs 0.950 (0.660–1.120) GE/mL in the comparison group (p<0.00001); higher count of Gardnerella/Prevotellabivia/Porphyromonas spp. – 2.310 (0.930–3.480) GE/mL vs 1.000 (0.000–1.860) GE/mL (p=0.003); higher count of Peptostreptococcus spp. – 0.195 (0.000–1.560) GE/mL vs 0.000 (0.000-0.000) GE/mL (p=0.032); Eubacterium spp. – 1.355 (0.100–2.460) GE/mL vs 0.000 (0.000–1.560) GE/mL (p=0.040).

Conclusion. Endometrial dysbiosis in patients with a uterus scar defect after cesarean section due to the possible effects of microorganisms can be considered one of the leading causes of the formation of a uterus scar defect in the postoperative period.

Keywords

uterine scar defect, chronic endometritis, endometrial microbiome

Full Text

Введение

Согласно данным современной литературы частота выявления хронического эндометрита (ХЭ) у пациенток репродуктивного возраста находится в широком диапазоне, достигая 98% [1]. ХЭ представляет собой патологическое состояние эндометрия, характеризующееся персистирующим воспалительным процессом c инфильтрацией плазматических клеток в строму эндометрия. «Золотым стандартом» диагностики данной патологии является морфологическое исследование биоптатов эндометрия, которое позволяет обнаружить плазматические клетки, диссоциированное созревание между эпителием и стромой, а также выраженную предецидуальную реакцию и высокую пролиферативную активность стромальных клеток. Описанные гистологические признаки могут быть подтверждены окрашиванием гематоксилином и эозином, однако в некоторых случаях возникают трудности с обнаружением данных клеток в эндометрии вследствие моноцитарной инфильтрации, стромального митоза и плазмоцитоидного вида стромальных клеток.

В качестве дополнительной диагностики проводят иммуногистохимическое исследование эндометрия для выявления маркера плазматических клеток – CD138 – ввиду его хорошего окрашивания на их поверхности [2]. Роль этих клеток заключается в секреции большого количества антител, а также в контроле и регуляции аберрантных патогенов, предотвращающих прогрессирование острого воспаления. Согласно данным последних исследований у женщин с ХЭ изменяется сократительная способность матки вследствие аномальных субпопуляций лимфоцитов и измененного характера паракринных желез в эндометрии, что приводит к нарушению синхронизированного движения эндометрия и миометрия [3, 4].

В большинстве случаев ХЭ маскируется под клиникой аномальных маточных кровотечений, тазовой боли и диспареунии, но чаще всего протекает бессимптомно. В течение многих лет считалось, что полость матки стерильна благодаря барьерной функции слизистой цервикального канала. Данная гипотеза опровергнута, а современные исследования показали, что микроорганизмы обнаруживаются и в эндометрии. Кроме того, установлено, что микроорганизмы проникают через цервикальный канал благодаря функции перистальтического насоса матки.

Хронический воспалительный процесс в эндометрии, включающий избыточное накопление жидкости в клетках, повышение плотности стромальных клеток, инфильтраты плазматических клеток в строме, ассоциирован с колонизацией разными видами бактерий: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Gardnerella vaginalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Mycoplasma и Ureaplasma spp., Candida spp. [5]. Особая роль отводится микробным ассоциациям ввиду их более агрессивного воздействия.

В проведенных работах показано, что в эндометрии обитает большое количество видов условно-патогенных микроорганизмов – 129 штаммов: облигатные анаэробы – 61,4% (бактероиды, эубактерии, пептострептококки и др.), микроаэрофилы – 31,8% (генитальные микоплазмы и дифтероиды), факультативные анаэробы – 6,8% (стрептококки группы В и D, эпидермальный стафилококк) [6, 7]. В исследовании H. Verstraelen, включившем 19 женщин репродуктивного возраста, состав микробиома эндометрия представлен Bacteroides xylanisolvens, B. thetaiotaomicron, B. fragilis, неопределенными таксонами Pelomonas, Lactobacillus crispatus или L. iners в присутствии ядра Bacteroides [8].

По результатам современных исследований, в инфицировании эндометрия принимают участие в том числе представители вагинальной и цервикальной флоры [7]. E. Cicinelli и соавт. сделали предположение, что, исследуя только вагинальный и цервикальный секрет, невозможно точно определить состав микробиоценоза эндометрия у пациенток с ХЭ. Авторы провели бактериальное исследование ткани эндометрия у 438 пациенток с ХЭ, однако патогены обнаружили только у 73%. Кроме того, в 32,6% случаев у пациенток с выявленными патогенными микроорганизмами в вагинальном секрете и в ткани эндометрия находятся те же виды бактерий [9].

Считается, что одной из причин ХЭ является не только присутствие микроорганизмов в эндометрии, но и их взаимодействие с эндометриальным иммунитетом. B-лимфоциты находятся в базальном слое эндометрия на протяжении всего менструального цикла, составляя небольшой процент всех иммунных клеток этой области. При ХЭ ряд В-клеток не только инфильтрирует и агрегирует в строме функционального слоя эндометрия ввиду присутствия плазматических клеток, но и устремляется в просвет желез, проходя через железистые эпителиальные клетки, что связано с аберрантной экспрессией молекул адгезии и цитокинов, участвующих в экстравазации В-клеток [2]. В исследовании Y. Li и соавт. показано, что количество иммунных клеток в эндометрии у пациенток с ХЭ увеличено [10].

Необходимость пристального внимания к проблеме ХЭ связана с риском развития отдаленных последствий, приводящих к иммуносупрессии и нарушению процессов полноценной репарации тканей. Дисбаланс между микробиотой, гормональной и иммунной системами может приводить к неадекватным иммунным реакциям, подавлению иммунного ответа и доминированию патогенных бактерий над нормальной микрофлорой эндометрия. Данный механизм является основным звеном в патогенезе ХЭ [11].

Кроме того, ХЭ является одним из основных факторов риска развития осложнений после кесарева сечения, в том числе формирования неполноценного шва на матке [12]. Согласно данным мировой литературы травматизация миометрия во время операции приводит к неполноценным фазам пролиферации и репарации миометрия, тем самым создавая благоприятную среду для размножения микроорганизмов. Отсутствие корректной терапии на основании чувствительности антибактериальных препаратов к определенным микроорганизмам в послеоперационном периоде может привести к хроническому инфекционному процессу в эндометрии и в последующем к дефектам в зоне рубца на матке после операции кесарева сечения.

Материалы и методы

В исследование включили 80 женщин репродуктивного возраста. В 1-ю группу вошли 50 пациенток с дефектом рубца на матке после кесарева сечения, во 2-ю – 30 женщин с состоятельным рубцом на матке также после кесарева сечения. Данное проспективное когортное исследование проводили на базе ФГБУ НИИ ОММ. Все женщины подписали добровольное информированное согласие на участие. Пациенткам выполняли пайпель-биопсию эндометрия на 20–22-й день менструального цикла двухпросветным катетером, исключающим контаминацию образцов влагалищной и цервикальной микрофлорой. Для молекулярно-генетического исследования эндометрия применяли полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, используя набор реагентов «Фемофлор 16» (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва); табл. 1. Количество ДНК искомого материала в образце определяли с помощью программного обеспечения и выражали в геном-эквиваленте (ГЭ), пропорциональном количеству микроорганизмов.

Таблица 1. Состав комплекта реагентов «Фемофлор 16» Table 1. Composition of the Femoflor 16 reagent kit
Параметр	Определяемые показатели
Контроль	Взятие материала
	Положительный контроль
	Внутренний контрольный образец
Диагностика нормоценоза	Общая бактериальная масса
Диагностика нормоценоза	Lactobacillus spp.
Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы)	Enterobacteriасeae spp.
	Streptococcus spp.
	Staphylococcus spp.
Анаэробные микроорганизмы (строгие анаэробы)	G. vaginalis/Peptostreptococcus spp.
	Eubacterium spp.
	Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp.
	Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp.
	Prevotellabivia/Porphyromonas spp.
	Lachnobacterium spp./Clostridium spp.
	Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
	Atopobium vaginae
Микоплазмы	Mycoplasma spp.
Микоплазмы	Ureaplasma spp. (U. urealyticum + U. parvum)
Грибы	Candida spp.

Для выявления дисбиоза и роли микроорганизмов в общей бактериальной массе проводили анализ относительного количества отдельных микроорганизмов, которое вычисляли как логарифм отношения количества определяемого микроорганизма к величине общей бактериальной массы. Для сбора, транспортировки и хранения всех групп микроорганизмов использовали среду AMIES, являющуюся модификацией среды STUART. Идентификацию культур осуществляли на основании морфологических, культуральных и биохимических свойств выделенных микроорганизмов. Культивирование микрофлоры эндометрия проводили в аэробных и микроаэрофильных условиях. Для выделения лактобактерий и представителей условно-патогенной флоры использовали мясо-пептонный агар с добавлением донорской крови. Грибы рода Candida выращивали на среде Сабуро. Посевы инкубировали при температуре 37°C. Используя урогенитальный зонд типа А, производили взятие бактериального посева из цервикального канала.

В исследовании использовали методы математической статистики, реализованные в пакете прикладных программ Exсel, SPSS Statistics 22.0. Оценку характера распределения проводили методами Колмогорова–Смирнова и Лиллиефорса. Для нормально распределенных показателей использовали среднее значение и стандартное отклонение, а для показателей с несимметричным распределением – медиану и квартили (нижняя и верхняя границы нормы). Поскольку для нормально распределенных показателей среднее значение близко к медиане, в табл. 2 для показателей микробиома использованы медианы для всех показателей (нормально и ненормально распределенных), а для сравнения медиан в двух группах применяли критерий Манна–Уитни.

Результаты

Средний возраст пациенток в группе с дефектом рубца на матке составил 33,6±3,86 года, в группе сравнения – 31,3±5,02 года (p>0,05). В обеих группах антропометрические показатели статистически значимо не различались, у женщин отмечены средние параметры роста и веса. Средний индекс массы тела находился в пределах нормальных значений, в основной группе – 24,1±4,54 кг, в группе сравнения – 24,1±2,58 кг (p>0,05). Пациентки обеих групп сопоставимы по наличию соматической патологии и гинекологическому анамнезу.

Таблица 2. Состав микробиома эндометрия у пациенток исследуемых групп Table 2. Endometrial microbiome composition in patients of the study groups
Группа микроорганизмов	Определяемые показатели	1-я группа (медиана)	2-я группа (медиана)	p
Диагностика нормоценоза	Общая бактериальная масса	4,430 (3,500–5,210)	4,210 (3,670–5,420)	0,827
Диагностика нормоценоза	Lactobacillus spp.	2,600 (1,430–3,600)	3,550 (2,800–4,700)	0,016
Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы)	Enterobacteriасeae spp.	2,700 (1,700–3,300)	0,950 (0,660–1,120)	<0,00001
	Streptococcus spp.	3,270 (3,000–3,700)	1,030 (0,760–1,700)	<0,00001
	Staphylococcus spp.	3,450 (3,200–3,600)	0,560 (0,120–1,200)	<0,00001
Анаэробные микроорганизмы (строгие анаэробы)	G. vaginalis/Prevotellabivia/Porphyromonas spp.	2,310 (0,930–3,480)	1,000 (0,000–1,860)	0,003
	Eubacterium spp.	1,355 (0,100–2,460)	0,000 (0,000–1,560)	0,040
	Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp.	1,000 (0,000–1,780)	1,160 (0,600–1,510)	0,226
	Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp.	0,000 (0,000–1,970)	0,000 (0,000–1,900)	0,788
	Peptostreptococcus spp.	0,195 (0,000–1,560)	0,000 (0,000–0,000)	0,032
	Lachnobacterium spp./Clostridium spp.	0,535 (0,000–2,800)	0,000 (0,000–1,340)	0,136
	Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.	1,205 (0,000–2,000)	1,340 (0,000–1,600)	0,434
	A. vaginae	0,070 (0,000–2,000)	0,000 (0,000–1,000)	0,120
Микоплазмы	Mycoplasma spp.	0,000 (0,000–1,770)	0,000 (0,000–0,000)	0,056
Микоплазмы	Ureaplasma spp. (U. urealyticum + U. parvum)	0,000 (0,000–1,450)	0,000 (0,000–1,200)	0,472
Грибы	Candida spp.	0,000 (0,000–1,560)	0,000 (0,000–1,200)	0,561
Примечание. Полужирным выделены статистически значимые показатели.

Бактериальный посев из цервикального канала выявил патогенную микрофлору у 15 (30%) пациенток с дефектом рубца на матке, в группе сравнения патогенной микрофлоры в цервикальном канале не обнаружено (p<0,00001). Особенности, выявленные при микробиологическом исследовании эндометрия, представлены в табл. 2. При изучении структуры микробиоты эндометрия не выявлено статистически значимых различий в показателях общей бактериальной массы у пациенток исследуемых групп. Опираясь на данный показатель, возможно оценить общее количество бактерий в пробе. Снижение количества общей бактериальной массы ниже пороговых значений может свидетельствовать о недостаточном заселении исследуемого биотопа бактериями.

Обращает на себя внимание более низкое содержание количества лактобактерий в эндометрии у пациенток с истонченным рубцом на матке – 2,600 (1,430–3,600) ГЭ/мл в отличие от данного показателя у пациенток группы сравнения – 3,550 (2,800–4,700) ГЭ/мл, что имело статистически значимые различия (p=0,02). Lactobacillus spp. составляют основу нормальной микрофлоры влагалища женщины. Абсолютный показатель их уровня в большинстве случаев не отличается от показателя общей бактериальной массы и составляет 106 и 108 для вагинальных соскобов, и он на порядок меньше для цервикального канала, однако стандартизированные показатели для эндометрия отсутствуют. В работе Н.А. Гомболевской показана высокая частота выявления Lactobacillus spp. в эндометрии у пациенток с ХЭ [13]. В среднюю стадию секреторной фазы путем апокриновой секреции в полость матки выделяется гликоген, который может служить субстратом для размножения лактобактерий [14].

При изучении группы аэробных микроорганизмов обнаружено, что у пациенток с дефектом рубца на матке статистически значимо чаще в эндометрии выявляются Streptococcus и Staphylococcus spp., чем у пациенток в группе сравнения, – 3,270 (3,000–3,700) ГЭ/мл и 3,450 (3,200–3,600) ГЭ/мл против 1,030 (0,760–1,700) ГЭ/мл и 0,560 (0,120–1,200) ГЭ/мл соответственно (p<0,00001). Кроме того, большее содержание Enterobacteriасeae также отмечено у пациенток с дефектом рубца на матке – 2,700 (1,700–3,300) ГЭ/мл против 0,950 (0,660–1,120) ГЭ/мл в группе сравнения (p<0,00001).

По данным Н.Д. Цыпурдеевой и соавт., состав микробиоты эндометрия при ХЭ характеризуется значительным увеличением частоты выявления стрептококков (в 8 раз; до 56%) и стафилококков (в 1,5 раза; до 80%) [15]. В исследовании E. Cicinelli и соавт., изучавших роль микроорганизмов в развитии ХЭ, также отмечена высокая частота выявления стрептококков (28%) и стафилококков (5%) в эндометрии. Кроме того, авторы подчеркивают, что стрептококки и стафилококки значительно чаще определялись именно в эндометрии, чем в вагинальном секрете [16].

В группе пациенток с дефектом рубца на матке в образцах эндометрия выявлено значимое преобладание облигатно-анаэробных микроорганизмов: Gardnerella/Prevotellabivia/Porphyromonas spp. – 2,310 (0,930–3,480) ГЭ/мл против 1,000 (0,000–1,860) ГЭ/мл в группе сравнения (p=0,003); Peptostreptococcus spp. – 0,195 (0,000–1,560) ГЭ/мл против 0,000 (0,000–0,000) ГЭ/мл во 2-й группе (p=0,032); Eubacterium spp. – 1,355 (0,100–2,460) ГЭ/мл против 0,000 (0,000–1,560) ГЭ/мл в группе сравнения (p=0,040). В том числе у пациенток обеих групп зарегистрирована Mycoplasma spp. (M. hominis + M. genitalium) в эндометрии, однако статистически значимых различий не выявлено – 0,000 (0,000–1,770) ГЭ/мл против 0,000 (0,000–0,000) ГЭ/мл в группе сравнения (p=0,056). По данным А.М. Савичевой и соавт., микроорганизмы, ассоциированные с бактериальным вагинозом, такие как G. vaginalis, встречаются в биоптатах эндометрия в 11,03% случаев, M. hominis – в 9,65% случаев [17]. Урогенитальные уреаплазмы и дрожжеподобные грибы рода Candida не имели достоверных различий у пациенток обеих групп. Кроме того, группа российских ученых показала, что при ХЭ доминируют факультативноанаэробные микроорганизмы Streptococcus spp. – 23,7%, энтеробактерии – 13%, G. vaginalis – 15,8% [18].

Заключение

Таким образом, данные, полученные в ходе настоящего исследования, указывают, что полость матки не является стерильной средой, а у пациенток с дефектом рубца на матке в ткани эндометрия преобладают как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы. Присутствие в эндометрии у женщин репродуктивного возраста с дефектом рубца на матке Enterobacteriасeae, Streptococcus и Staphylococcus spp., Gardnerella/Prevotellabivia/Porphyromonas, Peptostreptococcus и Eubacterium spp., возможно, указывает на хронический длительно протекающий воспалительный процесс и дисбиотические изменения в эндометрии.

Преобладание большого количества различных патогенных микроорганизмов в эндометрии может быть ассоциировано с развитием ХЭ у пациенток с дефектом рубца на матке после операции кесарева сечения и является одной из возможных причин формирования данной патологии в позднем послеоперационном периоде. Тем не менее роль колонизации эндометрия данными микроорганизмами в развитии ХЭ до конца не изучена, что требует дальнейших исследований в этом направлении и введения стандартизированных показателей.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ НИИ ОММ №12/20 от 28.09.2020. Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской конвенции.

Ethics approval. The study was approved by the local ethics committee of Urals Scientific Research Institute for Maternal and Child Care №12/20 dated 28.09.2020. The approval and procedure for the protocol were obtained in accordance with the principles of the Helsinki Convention.

Информированное согласие на публикацию. Пациентки подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

About the authors