Первые клинико-морфологические результаты лечения больных миомой матки с использованием улипристала ацетата‌‌‌‌

Полный текст

В структуре гинекологических заболеваний лейо- миома матки (ЛМ) занимает значительное место - диагностируется у 20-40% женщин репродуктивного возраста [1-3]. ЛМ являются одной из основных при- чин аномальных маточных кровотечений, железодефицит- ной анемии, учащенного мочеиспускания, тазовой боли, диспареунии, бесплодия и выкидышей, что снижает каче- ство жизни пациенток [4-6]. ЛМ развивается при овуляторном менструальном цикле, а прогестерон является индуктором ее роста [1]. На клеточ- ном уровне прогестерон вызывает рост клеток лейомиомы, об этом свидетельствует увеличение экспрессии маркеров таблица 1. клинические показатели пациенток основной группы, М±s основная группа (n=13) клинические показатели до лечения через 3 мес после лечения Возраст, лет 36,7±4,7 Жалобы, % 84,6 - гиперполименорея30,8 - симптомы сдавления органов малого таза (учащенное мочеиспускание) Нет Размеры миомы матки, неделя беременности 15,4±1,0 12,5±0,9 Размеры доминантного узла (средний диаметр), см 10,0±0,7 6,9±0,4 Локализация доминантного узла Межмышечная (с центростремительным и центробежным ростом) Характер менструаций Меноррагии Аменорея Сопутствующие заболевания Нет Нежелательные явления Нет Оценка удобства применения препарата Эсмия Отлично таблица 2. клинические показатели пациенток контрольной группы, М±s клинические показатели контрольная группа (n=10) Возраст, лет 40,2±4,4 Размеры доминантного узла (средний диаметр), см 3,99±1,85 Локализация доминантного узла,% 80 (n=8) - интрамуральные лейомиомы 20 (n=2) - субмукозные лейомиомы Жалобы Меноррагия пролиферации в миоме во время лютеиновой фазы мен- струального цикла [7]. Иммуногистохимические исследо- вания доказывают, что до 90% клеток пролиферирующих миом матки содержат активные рецепторы прогестерона (РП), являющегося стимулятором эпидермального фактора роста, инсулиноподобного фактора роста 1 - главных ми- тогенов миомы и антиапоптотического протоонкогена Bcl-2, и тем самым прогестерон способствует росту миомы [1, 7]. В секреторную фазу цикла экспрессия маркеров про- лиферации в клетках ЛМ повышается, а активность апоп- тоза, соответственно, снижается. Улипристала ацетат (УА) является мощным и селектив- ным модулятором РП (СМРП) [8-10]. В проведенных иссле- дованиях на культурах клеток ЛМ были продемонстриро- ваны антипролиферативный и проапоптотический эф- фекты УА на клетки ЛМ, а также отсутствие его воздействия на нормальные клетки миометрия [11]. УА тканеспеци- фично обратимо конформирует прогестероновые рецеп- торы в тканях-мишенях, а также подавляет овуляцию без повышения уровня эстрогенов и антиглюкокортикоидной активности [9, 12]. СМРП лишь супрессируют выработку го- надотропинов и действуют непосредственно на эндомет- рий, вызывая аменорею. СМРП обладают фармакодинами- ческим эффектом в отношении эндометрия, который мо- жет способствовать индукции аменореи [13-15]. Учитывая, что прогестерон оказывает протективный эффект в отно- шении эстрогениндуцированной пролиферации эндомет- рия, возникает вопрос о продолжительном использовании СМРП в отношении риска развития гиперплазии эндомет- рия. В исследованиях применения УА в лечении больных миомой матки показано, что, несмотря на развивающиеся десинхронизации между железами и стромой эндометрия, а также расширение желез, они являются не вполне физио- логичными, но полностью доброкачественными и обрати- мыми через 6 мес после окончании курса терапии [13, 16]. Эти изменения в эндометрии под воздействием УА отне- сены к новой морфологической категории - PAEC (PRM-as- sociated endometrial changes - изменения эндометрия, ас- социированные с использованием модуляторов ПР) и авто- ризованы Европейским медицинским агентством (Eu- ropian Medicine Agency) [17, 18]. В культуре ткани гладкомышечных клеток (ГМК) ЛМ про- демонстрированы подавление пролиферативной активно- сти и индукция апоптоза [1, 19]. Однако исследования in vitro исключают значение аутокринно-паракринных пато- генетических механизмов, которые являются неотъемле- мыми звеньями сложных сигнальных путей, а оценка индекса апоптоза без сопоставления с уровнем митотической активности и пролиферации не вполне информативна. Таким образом, целью данного исследования стало про- ведение клинико-морфологического исследования с уче- том основных показателей роста миомы матки in vivo. Материалы и методы Нами отобраны группы пациенток с миомой матки, клинически однородные по возрасту, размерам миомы матки и доминантного узла, его локализации, клинической симпто- матике и гистологическому строению ЛМ (простые или обычные ЛМ). Из исследования были исключены паци- ентки с сочетанной патологией репродуктивной системы и соматическими заболеваниями (табл. 1, 2). Всего были обследованы 23 пациентки. Основную группу составили 13 женщин в возрасте от 27 до 42 лет (средний возраст 36,7±4,7 года), которым с целью предопе- рационного лечения назначали Эсмию (5 мг/сут в течение 3 мес), затем были выполнены органосохраняющие опера- ции - миомэктомии. В контрольную группу вошли 10 пациенток с ЛМ в возрасте от 33 до 48 лет (средний возраст 40,2±4,4 года), подвергнутые миомэктомии (4 наблюдения) и гистерэктомии (6 наблюдений), выполненным без предопе- рационной гормональной терапии или контрацепции. Критерии исключения: пациентки с гормональной терапией или контрацепцией в течение последних 3 мес перед назначением УА, оперативными вмешательствами на репродуктивных органах, онкологическими заболева- ниями (в том числе в анамнезе), наличием патологии эндо- метрия (гиперплазия, полипы и т.д.), шейки матки или яич- ников на момент операции, системными соматическими заболеваниями и нарушениями обмена веществ. Проведено комплексное гистологическое, иммуномор- фологическое и морфометрическое исследование удален- ных узлов ЛМ. Гистологический метод Использовали парафиновые блоки, изготовленные из операционного материала - фрагментов ткани лейомиом, фиксированных в 10% нейтральном забуференном форма- лине и по общепринятой методике залитых в парафин. Ги- стологические срезы толщиной 4-5 мкм, полученные на микротоме Leica (Германия), окрашивали гематоксилин- эозином и пикрофуксином по ван Гизону. Окрашенные гистологические препараты изучали и фо- тографировали, используя световой микроскоп DM-LB (Leica, Германия). Иммуноморфологический метод Использовали непрямой иммунопероксидазный метод с применением 7 первичных специфических моноклональ- ных антител. Гистологические срезы толщиной 4-5 мкм, изготовлен- ные из парафиновых блоков с помощью микротома Leica, помещали на покрытые специальным адгезивом (APES-аце- тон) предметные стекла. Эндогенную пероксидазу в депа- рафинированных срезах блокировали 3% перекисью водо- рода. Демаскировку антигенов производили по стандарт- ной схеме, в микроволновой печи в течение 20 мин при 600 Вт в 0,1 М растворе цитратного буфера (рH 6,0). Использовали 7 первичных специфических монокло- нальных антител к рецепторам эстрогенов (rabbit mono- clonal antibody, IgG [SP1], C-term, Spring Bioscience, USA); РП (rabbit monoclonal antibody, IgG [SP2], C-term, Spring Bio- science, USA); белку Ki-67 (mouse monoclonal antibody, IgG1 [MM1], Leica, UK); маркеру митозов, ядерному белку фосфо- гистону Н3 (Phosphohistone H3 [PHH3], rabbit polyclonal an- tibody, Cell Marque, Inc., USA); маркеру апоптоза - активной (расщепленной) каспазе-3 (apoptosis-related cysteine pepti- dase 3 [асtive], rabbit monoclonal antibody, IgG [E83-77], N-term, GeneTex, Inc., USA); ингибитору апоптоза Bсl-2 (Bcl-2 [124], mouse monoclonal antibody, IgG1, Cell Marque, USA); индуктору апоптоза Вах (Bax-antibody [E63], rabbit monoclonal antibody, IgG, GeneTex, USA). Гистологические срезы инкубировали с первичными ан- тителами 30-60 мин при температуре 37°С (рабочее разве- дение антисывороток от 1:100 до 1:400). Для визуализации результата реакции связывания антигена с антителом ис- пользовали систему детекции Novolink Polymer Detection System (Leica, UK). Применяли фермент (пероксидазу хрена) в присутствии субстрата (перекиси водорода) и спе- циального реактива (диаминобензидина). Конечный продукт реакции представляет собой мелкие коричневатые гранулы в участках локализации антигена. Для таких антигенов, как рецепторы к эстрогенам и проге- стерону, Ki-67, фосфогистону Н3 - это ядра клеток, для дру- гих - цитоплазма (активная каспаза-3) и/или цитоплазма и ядра клеток (Bcl-2, Bax). Проводили общепринятые отрицательные и положи- тельные контрольные процедуры на используемые ре- агенты и ткани при обработке параллельных срезов. Отри- цательный контроль заключался в проведении реакции с исключением первичных специфических антител (путем их замены неиммунным реактивом - бычьей сывороткой) или специфических антигенов. Положительный конт- роль - с использованием гистологических препаратов рака молочной железы. После проведения иммунопероксидазной реакции ги- стологические препараты докрашивали гематоксилином, изучали и фотографировали, используя световой микро- скоп DM-LB (Leica, Германия). Морфометрический метод Результаты иммуногистохимических реакций оценивали с помощью полуколичественного морфометрического ме- тода [20]. Вычисляли коэффициенты экспрессии (КЭ) изучаемых антигенов по единой схеме. Визуально оценивали интен- сивность окраски клеток (или только их ядер - для рецеп- торов эстрогенов и прогестерона, Ki-67, фосфогистона Н3) в баллах от 0 до 3 (отрицательная, слабая, умеренная и вы- раженная окраска) и подсчитывали процент позитивно окрашенных клеток при каждом значении интенсивности окраски (по 1000 клеток в 10 полях зрения с наиболее выраженной иммуногистохимической реакцией при ×400). КЭ рассчитывали для каждого наблюдения по формуле: КЭ=∑(Б×П)/100, где Б - интенсивность окраски в баллах (от 0 до 3), П - процент окрашенных ядер или клеток (от 0 до 100%) для каждого значения Б. Статистическую обработку исходных данных, в том числе определение выборочных средних и выборочных стандартных отклонений, проводили с использованием рис. 1. взаимосвязь размеров миомы матки до лечения и после в основной группе. Примечание. Область А - нет лечебного эффекта, область Б - есть лечебный эффект. рис. 2. относительные изменения размеров миомы матки в зави- симости от исходных значений, %. статистического пакета STATISTICA 7.0. Для проверки гипо- тезы о равенстве средних значений рассматриваемых вы- борок использован t-критерий Стьюдента. Гипотеза о до- стоверном различии средних значений принималась при уровне значимости a=0,05. Результаты исследования и их обсуждение На рис. 1 представлен результат сопоставления размеров миомы матки до и после лечения в виде графического ото- бражения (скатерограммы) пар значений: размеров миомы до и после лечения каждого из обследованных лиц. При этом по оси абсцисс откладывается показатель размеров ЛМ до лечения, а по оси ординат - размеров ЛМ после лече- ния. Линия диагонали отражает ситуацию/условие равен- ства размеров миомы, т.е. границу лечебного эффекта. На этом рисунке область А - нет лечебного эффекта, область Б - есть лечебный эффект, при этом чем дальше точка рас- полагается от диагонали, тем больше проявляет себя мас- штаб лечебного эффекта. Поэтому расстояние от диаго- нали до точки может быть использовано в качестве допол- нительной меры, характеризующей масштаб лечебного эффекта. Клинические показатели после 3 мес лечения препара- том Эсмия по 5 мг/сут у всех 13 пациенток изменились ста- тистически значимо по сравнению с исходными данными: размеры миомы матки сократились с соответствующих 15,4±1,0 нед беременности до соответствующих 12,5±0,9 нед беременности. Размеры доминантного узла досто- верно уменьшились на 3±0,4 см в диаметре, в первом же цикле развилась аменорея (прекратились жалобы на обильные менструации), отсутствовали симптомы сдавле- ния органов малого таза. При этом не было отмечено никаких нежелательных явлений, все женщины подчеркивали удобство использования препарата. Такие результаты со- гласуются с данными исследований зарубежных авторов [21-23]. Различие среднегрупповых значений размеров миомы матки статистически достоверно. Так, через 3 мес уменьше- ние среднегруппового значения размера миоматозного узла составило 30,4±2,8% (рис. 2). Данные результаты свиде- тельствуют о значительном терапевтическом эффекте на миому матки УА. Иммуногистохимическое исследование продемонстри- ровало в ЛМ основной группы тенденцию к повышению экспрессии РП ядрами ГМК ЛМ при сохранении рецепто- ров эстрогенов (рис. 3, а). В ЛМ основной группы статисти- чески достоверно РП экспрессировали 78,3±9,1% ядер ГМК ЛМ (КЭ равен 1,82±0,21), а в группе сравнения - только 67,4±3,3% ядер ГМК ЛМ (КЭ - 1,58±0,17). Статистически не- достоверно: меньшее число ядер ГМК ЛМ экспрессировало рецепторы эстрогенов, чем РП (табл. 3). В ЛМ основной группы выявлено выраженное и статисти- чески значимое снижение на 34,3% пролиферативной (экс- прессия Ki-67) и митотической активности ГМК ЛМ (экс- прессия фосфогистона Н3): достоверное снижение в основ- ной группе составило на 45,8% в сочетании со значитель- ной индукцией апоптоза (экспрессия активной каспазы-3: достоверное увеличение в основной группе на 94,4%); рис. 3, б-г. Так, в ЛМ основной группы зарегистрированная экспрессия в ГМК составила: Ki-67 - 0,0048±0,002, фосфоги- стона Н3 - 0,0006±0,0005, расщепленной каспазы-3 - 0,0035±0,0015. Соответствующие показатели в ГМК ЛМ группы сравнения составили: 0,0073±0,003, 0,001±0,001 и 0,002±0,001 при уровне значимости a=0,05 (см. табл. 3). Представляет интерес обнаруженное незначительное и статистически недостоверное снижение экспрессии инги- битора апоптоза Bcl-2 и повышение экспрессии индуктора апоптоза Вах (рис. 3, д, е). КЭ Bcl-2 в ГМК ЛМ основной группы составил 1,43±0,24, а группы сравнения - 1,56±0,18. Показатели КЭ Вах были равны соответственно 1,01±0,11 и 0,93±0,07 (см. табл. 1). В результате минимальное увеличе- ние индекса Bax/Bcl-2 (с 0,6 до 0,7) не соответствовало от- меченному нарастанию апоптоза ГМК ЛМ основной группы после терапии УА. Результаты исследования показали, что, несмотря на свойственный ЛМ полиморфизм строения даже в пределах одного гистологического варианта (в частности, простых ЛМ, включенных в исследование), в наблюдениях основ- ной группы был более выражен неравномерный склероз и гиалиноз стромы узлов и их псевдокапсулы. В отличие от ЛМ группы сравнения, в ЛМ после 3-месячных предопера- ционных курсов использования УА были значительно скле- розированы и гиалинизированы периваскулярные зоны роста, нередко с выраженным стенозом просвета артерий и редукцией микроциркуляторного русла (рис. 4, а). Только в ЛМ основной группы в отдельных сосудах были выявлены гиалиновые и смешанные тромбы (рис. 4, б), хотя они могут встречаться в любых подобных узлах ЛМ [24]. Для наблюдений основной группы были характерны более распространенные острые вторичные изменения ЛМ, представленные дистрофией ГМК ЛМ с формирова- нием очагов отека, некроза и кровоизлияний (рис. 4, в, г). В сходных по строению участках ЛМ из основной группы и группы сравнения обращал на себя внимание заметно меньший размер ГМК и их ядер в узлах ЛМ основной группы, что позволяет предположить уменьшение степени гипертрофии ГМК ЛМ после курса терапии УА. Иммуногистохимическое исследование продемонстри- ровало молекулярно-биологические основы действия УА на клетки ЛМ. УА подавляет пролиферативную и митотиче- скую активность в сочетании с индукцией апоптоза ГМК ЛМ, что подтверждает данные, полученные ранее в экспе- риментах in vitro, и результаты изучения активности про- цессов апоптоза ГМК ЛМ in vivo [1, 19]. Такое прямое или опосредованное пара- и аутокринными механизмами влияние УА на ГМК ЛМ объясняет гистологические особен- ности строения ЛМ после курса терапии с малоактивными рис. 3. основная группа, простые лейомиомы: а - экспрессия яд- рами ГМК ЛМ прогестероновых рецепторов; б - белка Ki-67; в - фос- фогистона Н3; г - экспрессия ГМК ЛМ активной (расщепленной) ка- спазы-3; д - Bcl-2; е - Bax. Примечание. Иммуногистохимическое исследование: а, д, е - ×250; б- г - ×400. таблица 3. экспрессия рецепторов эстрогенов, прогестерона, маркеров пролиферации (Ki-67), митотической активности (фос- фогистона н3), апоптоза (расщепленной каспазы-3), ингибитора (Bcl-2) и индуктора (Bax) апоптоза в ГМк лМ основной и группы сравнения, М±s экспрессия маркеров показатель контрольная группа (n=10) основная группа (n=13) рецепторы эстрогенов % 57,2±9,8% 63,1±10,4% КЭ 1,43±0,2 1,58±0,22 рп % 67,4±3,3% 78,3±9,1% КЭ 1,58±0,17 1,82±0,21* % 0,73±0,27% 0,48±0,16% Кi-67 0,007±0,003 0,005±0,002* фосфогистон н3 % 0,12±0,11% 0,07±0,05% КЭ 0,001±0,001 0,0006±0,0005* Активная каспаза-3 % 0,18±0,12% 0,35±0,16% КЭ 0,002±0,001 0,003±0,001* Bcl-2 % 66,5±7,6% 61,1±9,9% КЭ 1,56±0,18 1,43±0,24 вах % 61,7±11,26% 67,7±11,2% КЭ 0,93±0,07 1,01±0,11 *Различие показателей основной и группы сравнения статистически достоверно при уровне значимости a=0,05. периваскулярными зонами роста и признаками преоблада- ния синтетической активности ГМК ЛМ. рис. 4. основная группа, простые лейомиомы: а - выраженный склероз и гиалиноз периваскулярной зоны роста со стенозом про- света артерии; б - тромб в просвете вены; в - очаг дистрофических изменений ГМК ЛМ; г - очаг некроза с кровоизлиянием, склероз пе- риваскулярной зоны роста. Примечание: а - окраска пикрофуксином по ван Гизону; б- г - гема- токсилином и эозином; а, б -×400, в, г - ×250. Обнаруженная тенденция к повышению экспрессии РП клетками ЛМ после терапии УА, возможно, представляет со- бой компенсаторный процесс. Несмотря на статистически достоверное повышение ак- тивности процессов апоптоза ГМК ЛМ в наблюдениях ос- новной группы, обнаружено лишь незначительное и стати- стически недостоверное снижение экспрессии ингиби- тора апоптоза Bcl-2 и повышение - индуктора апоптоза Вах. В результате индекс Bax/Bcl-2 увеличивается мини- мально. Необходимы дальнейшие исследования для вы- яснения механизмов индукции апоптоза УА. Заключение Таким образом, молекулярно-биологические механизмы подавления роста и уменьшения размеров ЛМ под влиянием УА заключаются в ряде механизмов селективного влияния УА на миому матки: снижение процессов пролиферации и гипертрофии; индуцирование апоптоза; уменьшение мито- тической активности; снижение экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста; склероз и гиалиноз ЛМ. Рекомендованной пероральной дозой препарата Эсмия при лечении больных миомой матки является 1 таблетка (5 мг) 1 раз в сутки. Лечение следует начинать в течение 1-й недели менструального цикла и продолжать 3 мес. Паци- ентки должны быть проинформированы, что лечение пре- паратом Эсмия приводит к заметному уменьшению мено- метроррагий уже в течение первых 10 дней терапии и вы- зывает аменорею. Возобновление нормальных менструа- ций происходит, как правило, в течение 4 нед после завер- шения курса терапии препаратом Эсмия, если пациентка до этого времени не прооперирована. В настоящее время препарат Эсмия по 5 мг/сут зареги- стрирован в Российской Федерации для предоперацион- ного лечения умеренных и выраженных геморрагических и компрессионных симптомов у больных миомой матки. Однако уже вносятся изменения в инструкцию о возмож- ности повторных курсов терапии препаратом Эсмия при положительной клинической динамике. При дальнейшем изучении свойств этого препарата, дифференцированном подходе к выбору метода лечения он сможет занять и само- стоятельную нишу в лечении ряда больных миомой матки.

Об авторах

Александр Леонидович Тихомиров

ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И.Евдокимова Минздрава России

д-р мед. наук, проф., проф. каф. акушерства и гинекологии лечебного фак-та

Виктор Викторович Казенашев

ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И.Евдокимова Минздрава России

канд. мед. наук, ассистент каф. акушерства и гинекологии лечебного фак-та

Олег Вадимович Зайратьянц

ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И.Евдокимова Минздрава России

д-р мед. наук, проф., зав. каф. патологической анатомии

Игорь Борисович Манухин

ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И.Евдокимова Минздрава России

д-р мед. наук, проф., зав. каф. акушерства и гинекологии лечебного фак-та

Список литературы

Дополнительные файлы