Polymorphism of the maternal EGF gene is associated with the fetal growth retardation: a prospective comparative study

Full Text

Введение

В структуре осложнений беременности значимое место занимает задержка роста плода (ЗРП) [1]. Недостижение антропометрических характеристик плода (роста и веса), нормированных согласно сроку гестации показателей для соответствующего этноса и пола, свидетельствует о ЗРП [2]. Среди всех беременностей встречаемость ЗРП может достигать 8–10% [1]. ЗРП имеет неблагоприятные последствия как для перинатального периода (повышает риски асфиксии, аспирации меконием, респираторного дистресс-синдрома и других заболеваний, а также смертности в этот период), так и для взрослого возраста (увеличивает риски возникновения сердечно-сосудистой патологии, метаболических расстройств, таких как сахарный диабет 2-го типа и др.) [3, 4].

ЗРП имеет гетерогенную природу и может являться результатом воздействия целого ряда различных факторов плацентарного (морфофункциональные и эпигенетические нарушения в плаценте и др.), плодного (генетически детерминированные дефекты) и материнского (заболевания сердца и сосудов, дефицит и дисбаланс питания, гипоксические воздействия, влияние токсических веществ и др.) происхождения [1]. В настоящее время не вызывает сомнений значимая роль наследственных факторов среди причин ЗРП, в том числе генетических факторов материнского организма [5, 6]. По современным данным, масса тела новорожденного на 40% связана с наследственными факторами [1]. Несмотря на важное практическое значение вопросов, связанных с пониманием роли конкретных генетических детерминант материнского организма, обусловливающих ЗРП (эти данные могут применяться для формирования среди женщин группы риска по возникновению данного осложнения беременности), количество исследований, направленных на поиск рисковых для ЗРП генетических маркеров, в Российской Федерации весьма ограниченно, что определяет актуальность данной работы.

Цель исследования – изучить вовлеченность полиморфизма генов факторов роста и их рецепторов в формирование ЗРП.

Материалы и методы

В рамках данного проспективного исследования выполнен сравнительный генетический анализ 196 беременных с ЗРП и 324 беременных контрольной группы. Показатели среднего возраста женщин с ЗРП (26,63±4,41 года) и женщин контрольной группы с физиологическим течением гестации (26,17±4,98 года) были сопоставимы (р>0,05). Основанием для диагностики ЗРП являлось наличие несоответствия показателя расчетного веса плода (при отклонении более 10-го процентиля) нормативному для данного возраста гестации [6]. Оценка антропометрических характеристик новорожденного использовалась для подтверждения наличия ЗРП. Выборки для исследования формировались в профильных отделениях перинатального центра ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» в период 2008–2015 гг.

Критерии включения: одноплодная беременность на сроке родоразрешения (37–40 нед), принадлежность к русскому этносу, родившиеся и проживающие в Центральном Черноземье России. Основанием для включения в основную группу было наличие у беременной изолированной ЗРП, контрольная группа была сформирована из беременных с физиологической гестацией. Критерии исключения: срок гестации <37 нед и >40 нед, многоплодная беременность, наличие другой патологии беременности (преэклампсия, аномалии прикрепления и расположения плаценты, наличие резус-конфликта), врожденные пороки развития у плода, доброкачественные пролиферативные заболевания матки (миома матки) и аномалии ее развития, тяжелая соматическая патология, отказ женщины от участия в настоящем исследовании.

Исследование выполнено по стандартам надлежащей клинической практики и в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Данная работа была одобрена этическим комитетом медицинского института НИУ БелГУ (протокол №2 от 13.02.2008) и выполнялась при письменном информированном согласии всех обследованных женщин.

Обследование беременных выполнялось на сроке родоразрешения и включало: общеклинический анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, коагулограмму, определение уровня белка в суточной моче. Выполнялись кардиотокография, ультразвуковое исследование плода, допплерометрия с оценкой кровотока в сосудах пуповины и матки. Для исследования использовался биохимический анализатор Architect c4000 (Abbott, США). Ультразвуковая фетометрия проводилась на ультразвуковом аппарате экспертного класса Toshiba XARIO SSA-660A (Toshiba, Япония). При диагностике ЗРП осуществлялась оценка различий между полученными фетометрическими показателями и номограммами F. Hadlock по методике, представленной ранее [2]. Соматометрия новорожденного проводилась стандартным методом.

В работе выполнено генотипирование 5 однонуклеотидных полиморфных локусов генов факторов роста и их рецепторов: rs4444903 EGF, rs833061 VEGFA, rs2981582 FGFR2, rs6214 IGF1, rs1800469 TGFβ1, отобранных для исследования согласно их регуляторному потенциалу (использовался онлайн-ресурс HaploReg, версия программы 4.1, http://compbio.mit.edu/HaploReg) [7]. В качестве объекта для генетического исследования использовалась ДНК, полученная из венозной крови (образцы крови объемом 5 мл забирались из кубитальной вены в специальные этилендиаминтетраацетатсодержащие пробирки типа «Vacutainer»). Для выделения ДНК использовалась ранее представленная фенольно-хлороформная методика [8]. В работе использованы амплификатор CFX-96 Real-Time System (Bio-Rad, США), а также наборы реактивов для проведения полимеразной цепной реакции, произведенные для определения конкретных полиморфизмов ООО «ТестГен» (Ульяновск).

Проведено вычисление частотных характеристик генотипических и аллельных вариантов рассматриваемых полиморфизмов среди беременных с ЗРП и в контрольной группе, а также сопоставление выявленного распределения генотипических классов с ожидаемым согласно закону Харди–Вайнберга.

Ассоциативный анализ проводился методом логистической регрессии с коррекцией на множественные сравнения (выполнялся адаптивный пермутационный тест, позволяющий минимизировать ложноположительные результаты). С целью полного нивелирования влияния возраста женщин и их индекса массы тела (до беременности) на полученные нами результаты ассоциативного исследования данные медико-биологические характеристики как количественные переменные включались в генетический анализ в качестве кофакторов. После проведения пермутационного теста статистически значимым являлся уровень p_perm<0,05. Характер ассоциации оценивался на основе показателя отношения шансов (ОШ) и его 95% доверительного интервала (ДИ) [9]. Вычисления были выполнены в программной среде PLINK (версия программы 2.050, размещена в свободном доступе: http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/).

Оценка связи локусов с экспрессионной активностью генов проводилась по данным международного исследовательского консорциума GTEx Consortium, которые представлены в свободном доступе (http://www.gtexportal.org/), и ранее описанной методики: в качестве показателя связи локуса с транскрипционной активностью генов был использован коэффициент линейной регрессии (β), отражающий влияние альтернативного генетического варианта на изменение (повышение или уменьшение) нормализованного показателя генной экспрессии [10, 11]. Регуляторный (эпигенетический) потенциал локусов был оценен по данным интегрированного с ранее полученными результатами крупных международных проектов по функциональной геномике Roadmap Epigenomics и ENCODE биоинформатического ресурса HaploReg (версия программного обеспечения 4.1), который в онлайн-варианте доступен для пользователей (http://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php).

Результаты и обсуждение

При сопоставлении выявленного распределения генотипических классов по 5 рассматриваемым полиморфизмам: rs4444903 EGF, rs833061 VEGFA, rs2981582 FGFR2, rs6214 IGF1, rs1800469 TGFβ1 с ожидаемым согласно закону Харди–Вайнберга установлено их соответствие (p>0,05).

Определено, что у беременных с ЗРП аллель G rs4444903 гена EGF встречается в 1,14 раза чаще, чем у беременных с физиологическим течением гестации (р=0,035, р_perm=0,033; реализовано 605 пермутационных процедур), и является рисковым фактором для данного осложнения беременности (ОШ 1,28, 95% ДИ 1,00–1,65); табл. 1. Полученные нами материалы указывают на связь с возникновением ЗРП аллельного варианта G rs4444903 гена EGF в рамках генетических моделей взаимодействия аллелей: аддитивной (р=0,038, р_perm=0,039; осуществлено 512 пермутационных процедур) и доминантной (р=0,026, р_perm=0,031; проведено 655 пермутационных процедур). Данный генетический вариант повышает риск развития ЗРП (ОШ 1,33, 95% ДИ 1,02–1,75 и ОШ 1,62, 95% ДИ 1,06–2,47 соответственно); см. табл. 1.

 

Таблица 1. Частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов факторов роста и их рецепторов у беременных с ЗРП и в контрольной группе / Table 1. Frequencies of alleles and genotypes of polymorphic loci of the factors growth and their receptors in pregnant women with fetal growth retardation and in the control group
Локус, ген	Генотип, минорный аллель	Частоты генетических вариантов, n		Генетические модели, ОШ (95% ДИ)
		беременные с ЗРП (n=196)	контроль (n=324)	аллельная	аддитивная	доминантная	рецессивная
rs4444903 EGF	A/A	0,217 (42)	0,306 (98)	1,28 (1,00–1,65); р=0,05	1,33 (1,02–1,75); р=0,04	1,62 (1,06–2,47); р=0,03	1,28 (0,80–2,02); р=0,30
	A/G	0,576 (111)	0,522 (167)
	G/G	0,207 (40)	0,172 (55)
	Минорный аллель G	0,495	0,433
rs833061 VEGFA	C/C	0,301 (58)	0,281 (91)	0,93 (0,72–1,20); р=0,57	0,90 (0,70–1,17); р=0,44	0,88 (0,59–1,30); р=0,51	0,87 (0,56–1,36); р=0,54
	C/T	0,497 (96)	0,500 (162)
	T/T	0,202 (39)	0,219 (71)
	Минорный аллель T	0,451	0,469
rs2981582 FGFR2	C/C	0,432 (82)	0,411 (132)	0,94 (0,72–1,22); р=0,64	0,94 (0,72–1,23); р=0,65	0,90 (0,62–1,30); р=0,57	0,98 (0,57–1,66); р=0,93
	C/T	0,437 (83)	0,449 (144)
	T/T	0,131 (25)	0,140 (45)
	Минорный аллель T	0,350	0,365
rs6214 IGF1	G/G	0,349 (58)	0,417 (100)	1,28 (0,96–1,71); р=0,09	1,28 (0,95–1,72); р=0,11	1,34 (0,88–2,03); р=0,17	1,43 (0,80–2,58); р=0,23
	G/A	0,488 (81)	0,471 (113)
	A/A	0,163 (27)	0,112 (27)
	Минорный аллель A	0,407	0,348
rs1800469 TGFβ1	C/C	0,396 (76)	0,448 (143)	1,12 (0,86–1,46); р=0,40	1,17 (0,90–1,52); р=0,24	1,31 (0,91–1,90); р=0,15	1,08 (0,64–1,83); р=0,78
	C/T	0,463 (89)	0,411 (131)
	T/T	0,141 (27)	0,141 (45)
	Минорный аллель T	0,372	0,346
Примечание. Результаты получены методом логистической регрессии с коррекцией на кофакторы (возраст и индекс массы тела женщины до беременности); жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.

 

Выполненная оценка эпигенетических эффектов rs4444903, занимающего позицию в области 5'-UTR участка гена EGF, показала его выраженную функциональную роль в организме: данный локус расположен в области модификаций белков-гистонов, которые маркируют промоторы (в более чем 20 разных органах и тканях) и энхансеры (в более чем 10 разных органах и тканях), регион функционально активного «открытого хроматина» (в 9 тканях) и местах взаимодействия ДНК с 3 белками – регуляторами транкрипции (CJUN, MAFK, POL2). Интересными представляются факты, указывающие на выраженные эпигенетические эффекты данного локуса в таких значимых для развития ЗРП структурах, как клетки – предшественники зародышевых листков – мезо-, энто- и эктодермы (hESC Derived CD56+ Mesoderm Cultured Cells, hESC Derived CD184+ Endoderm Cultured Cells, hESC Derived CD56+ Ectoderm Cultured Cells), предшественники трофобласта (H1 BMP4 Derived Trophoblast Cultured Cells), мезенхимальных стволовых клеток (H1 Derived Mesenchymal Stem Cells), прогенеторных нервных клеток (H1 и H9 Derived Neuronal progenitor Cultured Cells) и др. Также rs4444903 демонстрирует значимый регуляторный потенциал в разных органах плода (головной мозг, мышечная ткань, надпочечники и др.), взрослого организма (разные отделы головного мозга, жировая ткань, скелетная мускулатура, яичники и др.) и провизорных органах (амнион, плацента), вовлеченных в патофизиологию ЗРП.

Материалы международного консорциума GTExConsortium указывают на значимое влияние рассматриваемого нами локуса rs4444903 EGF на транскрипционную активность генов EGF и GAR1 в разных органах, тканях и морфологических структурах организма. При этом аллельный вариант G rs4444903 EGF ассоциирован с более высоким уровнем экспрессии гена EGF в гипофизе головного мозга (β=0,65; р=1,80E-22 при p_FDR≤0,05), периферической крови (β=0,095; р=0,00011 при p_FDR≤0,05), культуре клеток фибробластов (β=0,20; р=0,000051 при p_FDR≤0,05), скелетной мускулатуре (β=0,13; р=0,000035 при p_FDR≤0,05) и нервах (β=0,22; р=9,5E-06 при p_FDR≤0,05). Наряду с этим данный генетический вариант определяет пониженную транскрипционную активность гена GAR1 в базальных ганглиях головного мозга (β=-0,27; р=0,000018 при p_FDR≤0,05) и артериях (β=-0,14; р=0,000021 при p_FDR≤0,05). Также в базе данных указанного международного консорциума имеется информация о связи локуса rs4444903 EGF с показателем альтернативного сплайсинга гена GAR1 (ID интрона 109815804:109817936:clu_43835): аллель G rs4444903 ассоциирован с повышенным значением альтернативного сплайсинга (β=0,21; р=0,000014 при p_FDR≤0,05).

Итак, локус rs4444903 гена EGF, ассоциированный с развитием ЗРП, согласно полученным нами данным, обладает существенными эпигенетическими эффектами и детерминирует экспрессию генов EGF и GAR1 и альтернативный сплайсинг гена GAR1. Следует отметить, что аллельный вариант G rs4444903, являющийся рисковым для ЗРП (ОШ 1,28–1,62), связан с повышенной транскрипционной активностью гена EGF, низкой экспрессией гена GAR1 и более высоким уровнем альтернативного сплайсинга интронных участков гена GAR1. Примечателен тот факт, что rs4444903 гена EGF проявляет свои функциональные эффекты в органах и тканях (плацента, головной мозг плода и взрослого организма и др.), являющихся значимыми для патофизиологии ЗРП.

Материалы, представленные в онлайн-базе GeneCards: The Human Gene Database (интернет-ресурс свободного доступа http://www.genecards.org/), свидетельствуют о том, что ген EGF (хромосомная локализация 4q25, HGNC ID: 3229) относится к суперсемейству генов эпидермальных факторов роста, а из кодируемого им препропротеина вследствие протеолитической трансформации образуется пептид – эпидермальный фактор роста (состоит из 53 аминокислот и имеет молекулярную массу 6,0 kD, OMIM 131530). Этот белок действует как мощный митогенный фактор, который играет важную роль в росте, пролиферации и дифференцировке многочисленных типов клеток (эктодермального и мезодермального происхождения). Биологические эффекты эпидермального фактора роста реализуются за счет его связывания со своим специфическим рецептором (рецептор эпидермального фактора роста, EGFR), расположенным на клеточной мембране [12]. Для гена EGF характерен альтернативный сплайсинг, результатом которого является образование множественных вариантов транскрипта, обусловливающих плейотропные эффекты данного гена в организме.

О важной роли гена EGF в процессах роста и развития организма свидетельствуют результаты исследований, проведенных R. Wong и соавт. [13] на модели трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих активную форму человеческого EGF. Согласно полученным авторами данным трансгенные мыши демонстрировали замедленный рост, а взрослые особи были стерильны. В последующей работе S. Chan и соавт. [14] определили, что эти эффекты были обусловлены снижением содержания связывающего белка 3 сывороточного инсулиноподобного фактора роста (IGFBP3; OMIM 146732). Авторы показали, что задержка роста была связана с изменением развития хондроцитов в ростовой пластинке, при этом остеобласты накапливались в эндосте и надкостнице.

Связь изучаемого нами полиморфизма rs4444903 с уровнем транскрипции гена EGF была ранее показана в работе М. Shahbazi и соавт. [15]. В данной работе на основе изучения выборки из более чем 200 представителей популяции Европы показано, что клеточные линии индивидуумов, гомозиготных по аллелю А rs4444903, отличаются более низкой продукцией эпидермального фактора роста в сравнении с клеточной популяцией индивидуумов, гомозиготных по аллелю G rs4444903 или гетерозиготных по данному локусу (генотип AG). Следует отметить, что наши результаты, полученные in silico и свидетельствующие о связи аллельного варианта G rs4444903 (рисковый фактор для ЗРП – ОШ 1,28–1,62) с повышенной транскрипционной активностью гена EGF в разных органах и тканях организма (периферическая кровь, культура клеток фибробластов, скелетная мускулатура и др.), полностью согласуются с данными указанной работы [15].

Как митогенный фактор роста EGF играет важную роль в развитии эмбриона уже с момента предимплантации [16, 17]. Показано, что EGF способствует предимплантационному росту эмбрионов, а также инвазии трофобластов и постимплантационному росту эмбрионов [16]. В исследовании развития эмбрионов свиней, оплодотворенных in vitro (экстракорпоральное оплодотворение), скорость образования бластоцист на стадии 2 клеток или морулы напрямую зависела от концентрации EGF [16]. Введение EGF значительно увеличивало скорость образования бластоцисты, общее количество клеток в бластоцисте, а также экспрессию белка EGFR в клонированных эмбрионах мышей, и эти эффекты усиливались при сочетании EGF и трансформирующего фактора роста α [17]. У беременных мышей снижение материнского EGF приводит к ограничению роста эмбрионов [14]. Таким образом, литературные данные указывают на важную синергическую роль EGF вместе с другими факторами роста в эмбриональном развитии.

Следует отметить, что медицинское значение полиморфизма rs4444903 гена EGF активно изучается различными научными коллективами: в базе данных PubMed Central (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc) представлено более 120 работ по данной тематике, причем подавляющее большинство этих исследований посвящено рассмотрению связи данного локуса с различными злокачественными новообразованиями (рак желудка, пищевода, печени, легких, мочевого пузыря, колоректальный рак и др.). Исследований, направленных на изучение вовлеченности локуса rs4444903 гена EGF в формирование осложнений, в доступной литературе мы не обнаружили, что свидетельствует о приоритете полученных в настоящей работе материалов, демонстрирующих ассоциации rs4444903 гена EGF с формированием ЗРП у населения России. Результаты этой работы дополняют полученные в предыдущих исследованиях сведения о значимом вкладе генетических детерминант в формирование как начального этапа (менархе) репродуктивного периода женщины [10], так и доброкачественных пролиферативных заболеваний женской репродуктивной системы [11, 18–20] у населения Центрального Черноземья Российской Федерации данными о молекулярно-генетических факторах осложнений беременности у женщин этого региона.

Заключение

Аллельный вариант G rs4444903 гена EGF является рисковым для ЗРП (ОШ 1,28–1,62). Данный локус обладает значимым эпигенетическим потенциалом и связан с транскрипционной активностью генов EGF и GAR1 и уровнем альтернативного сплайсинга интронных участков гена GAR1. Однонуклеотидный полиморфизм rs4444903 гена EGF проявляет свои функциональные эффекты в органах и тканях (плацента, головной мозг плода и взрослого организма и др.), являющихся значимыми для патофизиологии ЗРП.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.

About the authors

Oleg V. Golovchenko

Belgorod State University

Email: gol.doc@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8473-2601

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Belgorod

Irina V. Ponomarenko

Belgorod State University

Email: ponomarenko_i@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0002-5652-0166

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Belgorod

Mikhail I. Churnosov

Belgorod State University

Author for correspondence.
Email: churnosov@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1254-6134

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Belgorod

References

Supplementary files