Распространенность и межгенные взаимодействия полиморфизмов, ассоциированных с нарушениями гемостаза и фолатного обмена, при повторных ранних самопроизвольных выкидышах

Полный текст

Повторные ранние самопроизвольные выкидыши являются распространенным осложнением беременности, частота которого в мире достигает 5% и не имеет тенденции к снижению, несмотря на совершенствование методов прегравидарной подготовки пациенток и профилактики невынашивания беременности (НБ) [1, 2]. В настоящее время опубликовано огромное количество фундаментальных работ, посвященных патогенезу рецидивирующих потерь в ранние сроки гестации, однако в 40-75% случаев их причина остается полностью не выясненной [1-3]. Доказанными факторами повторных ранних выкидышей считаются анатомический, генетический, иммунный, инфекционный, эндокринный, экологический [1-5]. В последние годы в качестве конфаундеров данного заболевания рассматриваются тромбофилия и нарушения фолатного обмена. По заключению ряда исследователей, полиморфизмы FVL-1691G>A (фактор V Лейдена) и FII-20210G>A (протромбина) ассоциируются с повышенным риском ранних потерь беременности [5-7]. Полиморфизмы MTHFR-677C>Т и MTHFR-1298 A>C связывают с повышенной частотой как ранних, так и поздних выкидышей [8-10]. Известно, что ингибитор активатора плазминогена 1 (РАІ-1) чрезвычайно важен для реализации репродуктивной функции. Существует мнение, что повышение уровня PAI-1 приводит к потере беременности опосредованно за счет развития тромбозов и воспаления [11]. В метаанализе H. Chen и соавт. (2015 г.) и исследовании M. Salazar Garcia (2016 г.) показан повышенный риск ранних потерь беременности у носителей генотипа РАІ-1-4G4G, что авторы объясняют изменениями гормонального, иммунного и метаболического статуса пациенток [12, 13]. На фоне достаточно большого количества публикаций по этому аспекту проблемы сведения современной научной литературы об ассоциации полиморфизма РАІ-1-675-4G>5G с ранними выкидышами достаточно противоречивы [14-16]. При оценке взаимосвязи генетических полиморфизмов с риском развития заболеваний следует принимать во внимание явление межгенных взаимодействий [17] - возможность взаимодействия неаллельных генов, в результате которых при определенных сочетаниях генетических полиморфизмов могут меняться реализуемые ими эффекты [18]. Таким образом, мультилокусный анализ полиморфизмов генов, влияющих на состояние системы гемостаза и фолатный обмен, может выделить патогенетически значимые комбинации локусов, ассоциированные с повторными ранними потерями беременности. Цель - проанализировать частоту встречаемости полиморфизмов и комбинаций генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-6755G>4G и оценить их ассоциацию с повторными ранними самопроизвольными выкидышами. Материалы и методы В исследование были включены небеременные женщины раннего фертильного возраста (20-35 лет), не имевшие вредных привычек (курение, прием алкоголя или наркотических средств), соматических заболеваний и семейного анамнеза тромбозов и тромбоэмболий, без аномалий развития репродуктивных органов и нарушений менструального цикла. В основную группу вошли 50 пациенток, имевших в анамнезе от 2 до 5 спонтанных выкидышей в ранние сроки гестации (группа НБ). Малая численность данной группы обусловлена строгими критериями отбора: у всех пациенток были исключены антифосфолипидный синдром, генитальные инфекции, общие инфекционные заболевания (в том числе обусловленные TORCH-агентами), аномалии развития и заболевания матки, эндокринные нарушения как причины рецидивирующих ранних потерь беременности [2]. Группу контроля составили 50 женщин, имевших в прошлом нормальные роды, завершившиеся рождением здорового ребенка, без анамнеза спонтанных выкидышей, преждевременных родов, потери плода, преэклампсии/эклампсии и других акушерских осложнений. Генотипирование для выявления интересующих нас полиморфизмов проведено на ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови («Проба-РАПИД-генетика», ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва). В качестве метода использована полимеразная цепная реакция с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени (Амплификатор «ДТ-96», ЗАО «НПФ ДНК-Технология») с применением комплектов реагентов «КардиоГенетика Тромбофилия», «Генетика метаболизма фолатов» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»). Генетические исследования выполнены в НИИ молекулярной медицины ФГБОУ ВО ЧГМА. Частоты генотипов обследованных пациенток проверяли на соответствие закону Харди-Вайнберга. Качественные данные представлены в виде числа n и % (число больных с данным признаком, процент от их количества в группе) или десятичной доли единицы (р). Статистическая обработка результатов произведена с помощью пакета программ Statistica 10. Достоверность разницы между двумя средними показателями оценивали по критерию Стьюдента (t); между долями - по критерию χ2. Значения считали статистически достоверными при величине χ2>3,84, при р≤0,05. Для оценки распределения заявленных полиморфизмов генов и их аллелей использовали общую (χ2-тест, df=2) и мультипликативную (χ2-тест, df=1) модели наследования. Силу ассоциативной связи между изучаемыми генетическими полиморфизмами и ранними выкидышами оценивали по величине показателя V-Крамера и отношения шансов (ОШ). Доверительные интервалы (ДИ), приводимые в работе, строились для доверительной вероятности p=95%. Данное исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО ЧГМА (протокол №64 от 23.06.2014). Результаты и обсуждение Пациентки сравниваемых групп были репрезентативны по возрасту: средний возраст обследованных составил 31,0±3,3 года в группе контроля и 31,3±2,9 года у пациенток с НБ (p>0,05). Распространенность заявленных генетических полиморфизмов мы изучали на основании общей и мультипликативной модели наследования. Распределение частот генотипов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G и их аллелей соответствовало закону Харди-Вайнберга (табл. 1, 2). У женщин обеих исследуемых групп не идентифицированы носители мутантных генотипов FVL-1691АA или FII-20210АA (см. табл. 1). Гетерозиготный генотип FVL-1691GA зарегистрирован в 3 раза чаще у пациенток с НБ (6% vs 2%; χ2=1,04; p=0,59), при этом нами не выявлено статистически значимой ассоциативной связи между этим генотипом и повторными ранними потерями беременности (ОШ=3,13; 95% ДИ 0,31-31,14). Гетерозиготный генотип FII-20210GA обнаружен только в основной группе (4% vs 0%; χ2=2,04; p=0,36), но не продемонстрировал взаимосвязи с НБ (ОШ=5,21; 95% ДИ 0,24-111,24). Все женщины группы контроля (100%) являлись носителями нормального гомозиготного генотипа FII-20210GG, в то время как у пациенток с повторными ранними выкидышами в анамнезе 96% имели гомозиготный генотип FII-20210GG и 4% - гетерозиготный FII-20210GA (χ2=2,04; p=0,36). Гетерозиготный генотип PAI-1-5G4G более часто идентифицировался в группе пациенток с повторными выкидышами по сравнению с группой контроля (72% vs 32%; χ2=18,80; p=8,0E-5); см. табл. 1. Выявлена статистически значимая ассоциация гетерозиготного генотипа PAI-1-5G4G и риска повторных ранних выкидышей (ОШ 5,46; 95% ДИ 2,32-12,87). При этом нами не установлено повышенного риска НБ у носительниц мутантного генотипа PAI-1-4G4G (ОШ 0,41, 95% ДИ 0,18-0,96). Нами не обнаружено статистически значимых различий между группами в частоте встречаемости гетерозиготного генотипа MTHFR-677CT (62% vs 46%, p>0,05 соответственно группы НБ и контроля) и мутантного гомозиготного генотипа MTHFR-677TT (4% vs 10%, p>0,05). Аналогичные закономерности установлены при анализе распространенности полиморфизма гена MTHFR-1298А>C: в сравниваемых группах с одинаковой частотой идентифицированы гетерозиготный генотип MTHFR-1298АC (46% vs 40%, p>0,05) и мутантный генотип MTHFR-1298СС (8% vs 8%, p>0,05). Ассоциативной связи генетических полиморфизмов MTHFR и риска повторных выкидышей не выявлено (см. табл. 1). При анализе мультипликативной модели наследования нами не установлено ассоциации минорных аллелей полиморфизмов генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G с риском рецидивирующих ранних потерь беременности. Исходя из представления, что сочетание нескольких генетических полиморфизмов, являющихся потенциальными предикторами заболевания, увеличивают риск его развития [17-19], на II этапе исследования нами проведен анализ межгенных взаимодействий (табл. 3). Комбинации изучаемых полиморфизмов у женщин с невынашиванием регистрировались в 2,4 раза чаще (48% vs 20%; χ2=29,20, р=0,000; сильная связь V-Крамера), что существенно увеличивало риск развития заболевания (ОШ 3,69, 95% ДИ 1,52-8,97). Максимальный риск развития осложнения (ОШ 4,64, 95% ДИ 1,55-3,84) выявлен для сочетания 2 гетерозиготных вариантов минорных аллелей полиморфизма PAI-1-5G4G и MTHFR-677CT или MTHFR-1298AC или FV-1691GA, которые встречались в 3,4 раза чаще у женщин основной группы (34% vs 10%; χ2=8,73, р=0,004; средняя связь V-Крамера). Наибольшая величина показателя относительного риска обнаружена при сочетании генотипов PAI-1-5G4G и MTHFR-677CT (ОШ 5,27; 95% ДИ 1,1-25,7). Важной находкой явилось то, что комбинация генотипов PAI-1-5G4G и FV-1691GA имела место только у пациенток с рецидивирующими ранними потерями беременности (2% vs 0%). Дискуссия Наши результаты в целом подтвердили сведения современной литературы об участии полиморфизмов генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G в патогенезе повторных ранних выкидышей. В исследуемой когорте женщин не обнаружено ассоциации мутантных вариантов генотипов FV-1691G>A и FII-20210G>A с НБ. Более того, полиморфизмы FV-1691АA и FII-20210АA не идентифицированы ни у представительниц основной группы, ни в группе контроля. Данный факт можно объяснить, во-первых, небольшим объемом нашей выборки, обусловленной строгими критериями включения в исследование; во-вторых, тем, что носительницы генотипов FV-1691АA и FII-20210АA часто страдают первичным бесплодием [20]. Полученные нами данные совпадают с выводами R. Gonçalves и соавт. (2016 г.), которые также не выявили взаимосвязи полиморфизмов генов FV-1691G>A и FII-20210G>A с рецидивирующими ранними потерями беременности в небольших группах пациенток (137 женщин с двумя и более выкидышами до 12 нед гестации и 100 здоровых) [21]. Установлена статистически значимая ассоциативная связь между гетерозиготным генотипом PAI-1-5G4G (ОШ 5,46, 95% ДИ 2,32-12,87) и повышенным риском повторных выкидышей в ранние сроки беременности. Аналогичные закономерности обнаружили другие авторы при обследованиях более многочисленных групп женщин [7, 16]. и оценке частоты встречаемости генотипов MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C и минорных аллелей заявленных полиморфизмов MTHFR мы не выявили их ассоциации с риском повторных ранних потерь беременности. В метаанализе Y. Cao и соавт. (2013 г.) на основании исследования большой когорты женщин (1061 здоровая, 1163 с НБ), напротив, сделано заключение о наличии взаимосвязи рецидивирующих выкидышей в ранние сроки с носительством генов MTHFR-677CT, MTHFR-677ТT и в то же время продемонстрировано ее отсутствие при гетерозиготном и мутантном вариантах гена MTHFR-1298A>C [22]. Мы полностью поддерживаем мнение I. Nowak и соавт. (2017 г.), что для клинической практики важнее определять уровень гомоцистеина в плазме и рекомендовать пациентам принимать добавки фолиевой кислоты, а не проходить скрининг на полиморфизм гена MTHFR-1298A>C и MTHFR-677C>T [23]. Анализ полиморфизмов генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G у пациенток с повторными ранними выкидышами выявил наличие межгенных взаимодействий, повышающих в 2,4 раза риск развития данного осложнения беременности (ОШ 3,69, 95% ДИ 1,52-8,97). Наибольшую патогенетическую значимость имеет комбинация генотипов PAI-1-5G4G и FV-1691GA, которая имела место только у пациенток группы НБ. При оценке силы связи межгенных взаимодействий исследованных полиморфизмов с рецидивирующими ранними потерями беременности максимальный показатель относительного риска установлен для комбинации полиморфизма PAI-1-5G4G и MTHFR-677CT (ОШ 5,27; 95% ДИ 1,1-25,7). На основании полученных результатов и современных сведений о биологических эффектах, реализуемых изучаемыми полиморфизмами генов, можно заключить, что при сочетании в геноме потенциальных предикторов гипергомоцистеинемии, гиперкоагуляции и снижения активности фиблинолиза образуются микротромбы и возникают расстройства микроциркуляции, что приводит к нарушениям плацентации, маточно-плацентарного кровообращения и может быть одной из причин НБ [19, 24]. Заключение Полученные результаты подтверждают наличие синергического взаимодействия между полиморфными локусами генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G при повторных ранних выкидышах: комбинации 2 гетерозиготных вариантов минорных аллелей повышают риск развития осложнения беременности. Сочетание генотипов FV-1691GA и PAI-1-5G4G может претендовать на роль молекулярно-генетического предиктора рецидивирующих ранних потерь беременности.

Об авторах

Наталия Ивановна Фролова

ФГБОУ ВО ЧГМА

Email: *taasyaa@mail.ru
канд. мед. наук, ассистент каф. акушерства и гинекологии педиатрического фак-та, ФПК и ППС

Татьяна Евгеньевна Белокриницкая

ФГБОУ ВО ЧГМА

Email: tanbell24@mail.ru
д-р мед. наук, проф., зав. каф. акушерства и гинекологии педиатрического фак-та, ФПК и ППС

Наталья Николаевна Страмбовская

ФГБОУ ВО ЧГМА

Email: strambovskaya@yandex.ru
канд. мед. наук, доц., зав. лаб. молекулярной генетики НИИ молекулярной медицины

Е П Белозерцева

ФГБОУ ВО ЧГМА

Email: belev.chita@mail.ru
канд. мед. наук, доц. каф. акушерства и гинекологии педиатрического фак-та, ФПК и ППС

Список литературы

Дополнительные файлы