Gene-gene interactions and prevalence of gene polymorphism associated with disorders of hemostasis and folate metabolism in patients with recurrent miscarriage

Full Text

Повторные ранние самопроизвольные выкидыши являются распространенным осложнением беременности, частота которого в мире достигает 5% и не имеет тенденции к снижению, несмотря на совершенствование методов прегравидарной подготовки пациенток и профилактики невынашивания беременности (НБ) [1, 2]. В настоящее время опубликовано огромное количество фундаментальных работ, посвященных патогенезу рецидивирующих потерь в ранние сроки гестации, однако в 40-75% случаев их причина остается полностью не выясненной [1-3]. Доказанными факторами повторных ранних выкидышей считаются анатомический, генетический, иммунный, инфекционный, эндокринный, экологический [1-5]. В последние годы в качестве конфаундеров данного заболевания рассматриваются тромбофилия и нарушения фолатного обмена. По заключению ряда исследователей, полиморфизмы FVL-1691G>A (фактор V Лейдена) и FII-20210G>A (протромбина) ассоциируются с повышенным риском ранних потерь беременности [5-7]. Полиморфизмы MTHFR-677C>Т и MTHFR-1298 A>C связывают с повышенной частотой как ранних, так и поздних выкидышей [8-10]. Известно, что ингибитор активатора плазминогена 1 (РАІ-1) чрезвычайно важен для реализации репродуктивной функции. Существует мнение, что повышение уровня PAI-1 приводит к потере беременности опосредованно за счет развития тромбозов и воспаления [11]. В метаанализе H. Chen и соавт. (2015 г.) и исследовании M. Salazar Garcia (2016 г.) показан повышенный риск ранних потерь беременности у носителей генотипа РАІ-1-4G4G, что авторы объясняют изменениями гормонального, иммунного и метаболического статуса пациенток [12, 13]. На фоне достаточно большого количества публикаций по этому аспекту проблемы сведения современной научной литературы об ассоциации полиморфизма РАІ-1-675-4G>5G с ранними выкидышами достаточно противоречивы [14-16]. При оценке взаимосвязи генетических полиморфизмов с риском развития заболеваний следует принимать во внимание явление межгенных взаимодействий [17] - возможность взаимодействия неаллельных генов, в результате которых при определенных сочетаниях генетических полиморфизмов могут меняться реализуемые ими эффекты [18]. Таким образом, мультилокусный анализ полиморфизмов генов, влияющих на состояние системы гемостаза и фолатный обмен, может выделить патогенетически значимые комбинации локусов, ассоциированные с повторными ранними потерями беременности. Цель - проанализировать частоту встречаемости полиморфизмов и комбинаций генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-6755G>4G и оценить их ассоциацию с повторными ранними самопроизвольными выкидышами. Материалы и методы В исследование были включены небеременные женщины раннего фертильного возраста (20-35 лет), не имевшие вредных привычек (курение, прием алкоголя или наркотических средств), соматических заболеваний и семейного анамнеза тромбозов и тромбоэмболий, без аномалий развития репродуктивных органов и нарушений менструального цикла. В основную группу вошли 50 пациенток, имевших в анамнезе от 2 до 5 спонтанных выкидышей в ранние сроки гестации (группа НБ). Малая численность данной группы обусловлена строгими критериями отбора: у всех пациенток были исключены антифосфолипидный синдром, генитальные инфекции, общие инфекционные заболевания (в том числе обусловленные TORCH-агентами), аномалии развития и заболевания матки, эндокринные нарушения как причины рецидивирующих ранних потерь беременности [2]. Группу контроля составили 50 женщин, имевших в прошлом нормальные роды, завершившиеся рождением здорового ребенка, без анамнеза спонтанных выкидышей, преждевременных родов, потери плода, преэклампсии/эклампсии и других акушерских осложнений. Генотипирование для выявления интересующих нас полиморфизмов проведено на ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови («Проба-РАПИД-генетика», ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва). В качестве метода использована полимеразная цепная реакция с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени (Амплификатор «ДТ-96», ЗАО «НПФ ДНК-Технология») с применением комплектов реагентов «КардиоГенетика Тромбофилия», «Генетика метаболизма фолатов» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»). Генетические исследования выполнены в НИИ молекулярной медицины ФГБОУ ВО ЧГМА. Частоты генотипов обследованных пациенток проверяли на соответствие закону Харди-Вайнберга. Качественные данные представлены в виде числа n и % (число больных с данным признаком, процент от их количества в группе) или десятичной доли единицы (р). Статистическая обработка результатов произведена с помощью пакета программ Statistica 10. Достоверность разницы между двумя средними показателями оценивали по критерию Стьюдента (t); между долями - по критерию χ2. Значения считали статистически достоверными при величине χ2>3,84, при р≤0,05. Для оценки распределения заявленных полиморфизмов генов и их аллелей использовали общую (χ2-тест, df=2) и мультипликативную (χ2-тест, df=1) модели наследования. Силу ассоциативной связи между изучаемыми генетическими полиморфизмами и ранними выкидышами оценивали по величине показателя V-Крамера и отношения шансов (ОШ). Доверительные интервалы (ДИ), приводимые в работе, строились для доверительной вероятности p=95%. Данное исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО ЧГМА (протокол №64 от 23.06.2014). Результаты и обсуждение Пациентки сравниваемых групп были репрезентативны по возрасту: средний возраст обследованных составил 31,0±3,3 года в группе контроля и 31,3±2,9 года у пациенток с НБ (p>0,05). Распространенность заявленных генетических полиморфизмов мы изучали на основании общей и мультипликативной модели наследования. Распределение частот генотипов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G и их аллелей соответствовало закону Харди-Вайнберга (табл. 1, 2). У женщин обеих исследуемых групп не идентифицированы носители мутантных генотипов FVL-1691АA или FII-20210АA (см. табл. 1). Гетерозиготный генотип FVL-1691GA зарегистрирован в 3 раза чаще у пациенток с НБ (6% vs 2%; χ2=1,04; p=0,59), при этом нами не выявлено статистически значимой ассоциативной связи между этим генотипом и повторными ранними потерями беременности (ОШ=3,13; 95% ДИ 0,31-31,14). Гетерозиготный генотип FII-20210GA обнаружен только в основной группе (4% vs 0%; χ2=2,04; p=0,36), но не продемонстрировал взаимосвязи с НБ (ОШ=5,21; 95% ДИ 0,24-111,24). Все женщины группы контроля (100%) являлись носителями нормального гомозиготного генотипа FII-20210GG, в то время как у пациенток с повторными ранними выкидышами в анамнезе 96% имели гомозиготный генотип FII-20210GG и 4% - гетерозиготный FII-20210GA (χ2=2,04; p=0,36). Гетерозиготный генотип PAI-1-5G4G более часто идентифицировался в группе пациенток с повторными выкидышами по сравнению с группой контроля (72% vs 32%; χ2=18,80; p=8,0E-5); см. табл. 1. Выявлена статистически значимая ассоциация гетерозиготного генотипа PAI-1-5G4G и риска повторных ранних выкидышей (ОШ 5,46; 95% ДИ 2,32-12,87). При этом нами не установлено повышенного риска НБ у носительниц мутантного генотипа PAI-1-4G4G (ОШ 0,41, 95% ДИ 0,18-0,96). Нами не обнаружено статистически значимых различий между группами в частоте встречаемости гетерозиготного генотипа MTHFR-677CT (62% vs 46%, p>0,05 соответственно группы НБ и контроля) и мутантного гомозиготного генотипа MTHFR-677TT (4% vs 10%, p>0,05). Аналогичные закономерности установлены при анализе распространенности полиморфизма гена MTHFR-1298А>C: в сравниваемых группах с одинаковой частотой идентифицированы гетерозиготный генотип MTHFR-1298АC (46% vs 40%, p>0,05) и мутантный генотип MTHFR-1298СС (8% vs 8%, p>0,05). Ассоциативной связи генетических полиморфизмов MTHFR и риска повторных выкидышей не выявлено (см. табл. 1). При анализе мультипликативной модели наследования нами не установлено ассоциации минорных аллелей полиморфизмов генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G с риском рецидивирующих ранних потерь беременности. Исходя из представления, что сочетание нескольких генетических полиморфизмов, являющихся потенциальными предикторами заболевания, увеличивают риск его развития [17-19], на II этапе исследования нами проведен анализ межгенных взаимодействий (табл. 3). Комбинации изучаемых полиморфизмов у женщин с невынашиванием регистрировались в 2,4 раза чаще (48% vs 20%; χ2=29,20, р=0,000; сильная связь V-Крамера), что существенно увеличивало риск развития заболевания (ОШ 3,69, 95% ДИ 1,52-8,97). Максимальный риск развития осложнения (ОШ 4,64, 95% ДИ 1,55-3,84) выявлен для сочетания 2 гетерозиготных вариантов минорных аллелей полиморфизма PAI-1-5G4G и MTHFR-677CT или MTHFR-1298AC или FV-1691GA, которые встречались в 3,4 раза чаще у женщин основной группы (34% vs 10%; χ2=8,73, р=0,004; средняя связь V-Крамера). Наибольшая величина показателя относительного риска обнаружена при сочетании генотипов PAI-1-5G4G и MTHFR-677CT (ОШ 5,27; 95% ДИ 1,1-25,7). Важной находкой явилось то, что комбинация генотипов PAI-1-5G4G и FV-1691GA имела место только у пациенток с рецидивирующими ранними потерями беременности (2% vs 0%). Дискуссия Наши результаты в целом подтвердили сведения современной литературы об участии полиморфизмов генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G в патогенезе повторных ранних выкидышей. В исследуемой когорте женщин не обнаружено ассоциации мутантных вариантов генотипов FV-1691G>A и FII-20210G>A с НБ. Более того, полиморфизмы FV-1691АA и FII-20210АA не идентифицированы ни у представительниц основной группы, ни в группе контроля. Данный факт можно объяснить, во-первых, небольшим объемом нашей выборки, обусловленной строгими критериями включения в исследование; во-вторых, тем, что носительницы генотипов FV-1691АA и FII-20210АA часто страдают первичным бесплодием [20]. Полученные нами данные совпадают с выводами R. Gonçalves и соавт. (2016 г.), которые также не выявили взаимосвязи полиморфизмов генов FV-1691G>A и FII-20210G>A с рецидивирующими ранними потерями беременности в небольших группах пациенток (137 женщин с двумя и более выкидышами до 12 нед гестации и 100 здоровых) [21]. Установлена статистически значимая ассоциативная связь между гетерозиготным генотипом PAI-1-5G4G (ОШ 5,46, 95% ДИ 2,32-12,87) и повышенным риском повторных выкидышей в ранние сроки беременности. Аналогичные закономерности обнаружили другие авторы при обследованиях более многочисленных групп женщин [7, 16]. и оценке частоты встречаемости генотипов MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C и минорных аллелей заявленных полиморфизмов MTHFR мы не выявили их ассоциации с риском повторных ранних потерь беременности. В метаанализе Y. Cao и соавт. (2013 г.) на основании исследования большой когорты женщин (1061 здоровая, 1163 с НБ), напротив, сделано заключение о наличии взаимосвязи рецидивирующих выкидышей в ранние сроки с носительством генов MTHFR-677CT, MTHFR-677ТT и в то же время продемонстрировано ее отсутствие при гетерозиготном и мутантном вариантах гена MTHFR-1298A>C [22]. Мы полностью поддерживаем мнение I. Nowak и соавт. (2017 г.), что для клинической практики важнее определять уровень гомоцистеина в плазме и рекомендовать пациентам принимать добавки фолиевой кислоты, а не проходить скрининг на полиморфизм гена MTHFR-1298A>C и MTHFR-677C>T [23]. Анализ полиморфизмов генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G у пациенток с повторными ранними выкидышами выявил наличие межгенных взаимодействий, повышающих в 2,4 раза риск развития данного осложнения беременности (ОШ 3,69, 95% ДИ 1,52-8,97). Наибольшую патогенетическую значимость имеет комбинация генотипов PAI-1-5G4G и FV-1691GA, которая имела место только у пациенток группы НБ. При оценке силы связи межгенных взаимодействий исследованных полиморфизмов с рецидивирующими ранними потерями беременности максимальный показатель относительного риска установлен для комбинации полиморфизма PAI-1-5G4G и MTHFR-677CT (ОШ 5,27; 95% ДИ 1,1-25,7). На основании полученных результатов и современных сведений о биологических эффектах, реализуемых изучаемыми полиморфизмами генов, можно заключить, что при сочетании в геноме потенциальных предикторов гипергомоцистеинемии, гиперкоагуляции и снижения активности фиблинолиза образуются микротромбы и возникают расстройства микроциркуляции, что приводит к нарушениям плацентации, маточно-плацентарного кровообращения и может быть одной из причин НБ [19, 24]. Заключение Полученные результаты подтверждают наличие синергического взаимодействия между полиморфными локусами генов FVL-1691G>A, FII-20210G>A, MTHFR-677C>T, MTHFR-1298А>C, РАІ-1-675-5G>4G при повторных ранних выкидышах: комбинации 2 гетерозиготных вариантов минорных аллелей повышают риск развития осложнения беременности. Сочетание генотипов FV-1691GA и PAI-1-5G4G может претендовать на роль молекулярно-генетического предиктора рецидивирующих ранних потерь беременности.

About the authors

Nataly I Frolova

Chita State Medical Academy

Email: *taasyaa@mail.ru
Cand. Sci. (Med.) Chita, Russia

Tatiana E Belokrinitskaya

Chita State Medical Academy

Email: tanbell24@mail.ru
D. Sci. (Med.), Full Prof. Chita, Russia

Nataliya N Strambovskaya

Chita State Medical Academy

Email: strambovskaya@yandex.ru
Cand. Sci. (Med.) Chita, Russia

Evgeniya P Belozertseva

Chita State Medical Academy

Email: belev.chita@mail.ru
Cand. Sci. (Med.) Chita, Russia

References

Supplementary files